（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029）

施馬倫貝格病焦磷酸測序檢測方法的建立

王彩霞，林祥梅，張永寧，呂繼洲，馮春燕，袁向芬，鄧俊花，吳紹強(qiáng)

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029）

為適應(yīng)口岸施馬倫貝格病快速、準(zhǔn)確、高通量檢測需求，建立一種基于RT-PCR及焦磷酸測序技術(shù)平臺(tái)的施馬倫貝格病檢測方法。本研究針對施馬倫貝格病毒基因組RNA的S、M和L三個(gè)基因節(jié)段保守區(qū)域利用焦磷酸測序軟件PyroMark Q96ID分別設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸測序引物，以人工合成的SBV重組質(zhì)粒為模板分別建立了SBV S、M、L基因的PCR-焦磷酸測序檢測方法，比較三基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果以及測序分析結(jié)果，結(jié)合特異性檢測結(jié)果，最終確定以M基因作為靶基因建立的焦磷酸測序檢測方法效果最好，并以德國FLI提供的SBV（BH80株）RNA對所建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證，通過對測得序列的比對分析可確定為施馬倫貝格病毒，這表明本研究所建立的方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)，可以用于施馬倫貝格病毒基因序列水平上的精準(zhǔn)檢測鑒定。

施馬倫貝格病毒；聚合酶鏈反應(yīng)；焦磷酸測序；鑒定；檢測

施馬倫貝格?。⊿chmallenberg disease）是2011年11月首先在德國西部一個(gè)靠近荷蘭和比利時(shí)的小城鎮(zhèn)施馬倫貝格發(fā)現(xiàn)的，是一種新發(fā)蟲媒動(dòng)物傳染病。病牛出現(xiàn)發(fā)熱、精神不振、體質(zhì)下降、厭食、產(chǎn)奶量下降和腹瀉等臨床癥狀，有時(shí)會(huì)伴有流產(chǎn)癥狀[1]。施馬倫貝格病毒（SBV）基因組為單股負(fù)鏈RNA，可分為L、M和S三個(gè)基因節(jié)段，其中L編碼RNA依賴性RNA聚合酶；M編碼2種表面糖蛋白Gn和Gc以及一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白；S編碼核衣殼蛋白N和另一非結(jié)構(gòu)蛋白NSs[2-3]。N蛋白是SBV病毒粒子中含量最豐富的蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體最早的蛋白，可作為該病分子生物學(xué)和血清學(xué)診斷的靶蛋白[1，4-5]。

焦磷酸測序技術(shù)（pyrosequencing）是一種能夠進(jìn)行定量序列測定的短鏈測序技術(shù)，具有高通量、快速、敏感等特點(diǎn)。目前該技術(shù)在物種鑒定、病毒快速鑒定和分型、微生物檢測等方面應(yīng)用廣泛[6]。本研究針對SBV S、M、L三個(gè)基因節(jié)段的保守區(qū)域，

利用焦磷酸測序軟件分別設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸測序引物，建立了針對S、M、L三個(gè)基因節(jié)段的焦磷酸測序檢測方法，并以德國FLI提供的SBV RNA對所建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

SBV（BH80株）RNA由德國弗里德里希洛弗勒研究所（FLI）病毒診斷實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中發(fā)布的SBV S、M、L三個(gè)基因節(jié)段的序列，經(jīng)Blast分析比對，找出序列的保守區(qū)域，利用焦磷酸測序檢測系統(tǒng)自帶的引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物及測序引物（表1）。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，用滅菌水將其濃度配制為10μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 RT-PCR擴(kuò)增引物及測序引物

1.2.2 陽性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

通過對SBV S、M、L三個(gè)基因節(jié)段在線序列的查找與分析，選取包含其特異性序列的片段由大連寶生物公司進(jìn)行基因合成，其中S基因片段長度為702bp，M基因片段長度為710bp，L基因片段長度為600bp，并構(gòu)建到pMD19-T載體中，分別構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19-T-SBVS、pMD19-TSBVM、pMD19-T-SBVL。測定三種重組質(zhì)粒溶液的DNA濃度并換算為拷貝數(shù)，均10倍系列稀釋至10拷貝/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測靶基因的篩選

1.2.3.1 S、M、L三基因的焦磷酸測序—PCR擴(kuò)增

以系列稀釋的重組質(zhì)粒（107～101拷貝/μL）為模板，分別以相應(yīng)的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25μL的PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 2μL，10μmol/L上下游引物各1μL，5U/μLrTaq 0.5μL，質(zhì)粒DNA1μL，ddH2O補(bǔ)充至25μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃（S基因）/58℃（M和L基因）退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。PCR擴(kuò)增完畢，以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較三個(gè)基因的擴(kuò)增效率。

1.2.3.2 單鏈模板制備及焦磷酸測序

分別取PCR產(chǎn)物10μL加ddH2O補(bǔ)至50μL，在產(chǎn)物中分別加入磁珠3μL和結(jié)合緩沖液47μL，常溫震蕩混勻10min；打開真空泵，將真空預(yù)裝工具在超純水中清洗30s后抓取磁珠，分別在70%乙醇、變性緩沖液、洗滌緩沖液中清洗5～10s，將磁珠移至預(yù)先加入測序引物和退火緩沖液的PSQ96孔板中；將此PSQ96孔板放在ThermoPlate上置80℃3min，取出自然冷卻至室溫；設(shè)定測序程序及堿基投放順序和循環(huán)數(shù)，根據(jù)程序給定的劑量，在試劑艙中相應(yīng)的孔中加入酶混合物、底物混合物以及4種堿基，將試劑艙和96孔測序板放入焦磷酸測序儀PyroMark Q96ID的機(jī)箱中進(jìn)行測序反應(yīng)，反應(yīng)完畢，儀器自動(dòng)給出測序結(jié)果，對測序結(jié)果進(jìn)行在線BLAST分析，并比較其序列特異性。

1.2.4 特異性檢測

從GenBank中選擇沙門達(dá)病毒（Shamonda virus）、薩蘇伯里病毒（Sathuperi virus）、道格拉斯病毒（Douglas virus）、赤羽病病毒（Akabane virus）和艾羅病毒（Aino virus）M基因完整的編碼序列，由大連寶生物公司進(jìn)行基因合成并插入到pMD19-T載體中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒。以上述重組質(zhì)粒為對照樣品，以pMD19-T-SBVM重組質(zhì)粒為陽性對照，以ddH2O為陰性對照，進(jìn)行特異性檢測。PCR擴(kuò)增結(jié)束，以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 樣品檢測

采用本研究所建立的基于M基因的SBV焦磷酸測序方法對德國FLI病毒診斷實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)的SBV（BH80株）RNA樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。50μL反應(yīng)體系：10×One Step RNA PCR Buffer 5μL、25mol/LMgCl210μL、10mmol/LdNTP 5μL、40U/LRNase Inhibitor 1μL、5U/LAMV Optimized Taq 1μL、5U/μLAMV RTase XL 1μL、10mmo/ L上下游引物各1μL、SBV RNA 5μL、無RNA酶雙蒸水補(bǔ)充至50μL。反應(yīng)條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃熱滅活反轉(zhuǎn)錄酶2min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。

RT-PCR擴(kuò)增完畢，電泳檢測后取10μLRTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照1.2.3.2所述操作步驟進(jìn)行單鏈分離及測序試驗(yàn)，測序完畢，儀器自動(dòng)給出測序結(jié)果，比較檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 檢測靶基因的篩選

2.1.1 重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析

利用設(shè)計(jì)的SBV-S、SBV-M、SBV-L基因的特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，10倍系列稀釋梯度質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。SBV-S基因的目的片段長度為189bp，107-104拷貝/μL重組S基因質(zhì)粒均得到了與預(yù)期大小一致的目的條帶；SBV-M基因的目的片段長度為250bp，107-104拷貝/μL重組M基因質(zhì)粒均得到了與預(yù)期大小一致的目的條帶；SBV-L基因的目的片段長度為344bp，107-105拷貝/μL重組L基因質(zhì)粒均得到了與預(yù)期大小一致的目的條帶。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，可以看出S基因和M基因的擴(kuò)增效率比較高，L基因擴(kuò)增效率較低，不再進(jìn)行后續(xù)測序研究。

2.1.2 S、M基因PCR產(chǎn)物的焦磷酸測序

圖1 SBV S、M、L三基因重組梯度質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

根據(jù)電泳結(jié)果，選擇SBV S、M兩基因重組梯度質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，測序結(jié)果見圖2。其中，SBV S基因107-104拷貝/ μL質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均可測得一致序列：TAAGGGATGC ACCTGGGCCG ATGGTTATAC AATGTATCTT GGATTTGC，將此序列在網(wǎng)上進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果與SBV序列的一致性可達(dá)100%，但是該序列與道格拉斯病毒（Douglas virus）序列的一致性也為100%，因此通過該序列來達(dá)到SBV的鑒別診斷比較困難。SBV M基因107-104拷貝/μL質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均可測得一致序列：TGGAGAAAGC CTCTTTTCCA TTATTATCTA TG，將此序列在網(wǎng)上進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示序列一致性為100%的均為SBV，表明該序列的特異性較好，可以用作SBV基因序列水平上的精準(zhǔn)檢測。

圖2重組梯度質(zhì)粒PCR產(chǎn)物的焦磷酸測序結(jié)果

2.2 特異性檢測結(jié)果

以構(gòu)建的沙門達(dá)病毒、薩蘇伯里病毒、道格拉斯病毒、赤羽病病毒和艾羅病毒的重組質(zhì)粒為

對照樣品，以pMD19-T-SBVM重組質(zhì)粒為陽性對照，以ddH2O為陰性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束，以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，只有陽性對照擴(kuò)增出了目的片段，其余均未見目的條帶，表明，本研究所設(shè)計(jì)的SBV-M基因的擴(kuò)增引物具有較好的特異性。

圖3 SBV-M基因PCR擴(kuò)增的特異性檢測

2.3 SBV（BH80株）RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析

以SBV-M基因的特異性引物對德國FLI病毒診斷實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)的SBV RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后，以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到了與預(yù)期大小一致的目的片段（圖4）。

圖4 SBV（BH80株）RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.4 SBV（BH80株）RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測序檢測結(jié)果

對SBV（BH80株）M基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，反應(yīng)結(jié)束，儀器自動(dòng)給出的測序結(jié)果為：TGGAGAAAGC CTCTTTTCCA TTATTATCTA TGTCAGAAGA GT（圖5），將此序列在網(wǎng)上進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明序列一致性為100%的均為SBV，驗(yàn)證了本研究建立的焦磷酸測序檢測方法可以精確鑒別施馬倫貝格病毒。

圖5 SBV（BH80株）RNA RT-PCR產(chǎn)物的焦磷酸測序結(jié)果

3 討論

施馬倫貝格病是一種新發(fā)動(dòng)物疫病。自FLI在德國奶牛場首次確診該病以來，荷蘭、比利時(shí)、法國、俄羅斯、土耳其等數(shù)十個(gè)國家相繼報(bào)道了該病的爆發(fā)與流行[1，7-8]，該病具有非常強(qiáng)的跨境傳播能力，給相關(guān)國家的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。截至目前，我國未見該病的相關(guān)報(bào)道，因此，加強(qiáng)口岸檢疫，嚴(yán)防該病的侵入，成為防治該病的重中之重，這就需要我們加強(qiáng)該病的檢測技術(shù)研究，為該病的檢測做好技術(shù)儲(chǔ)備。目前，該病的診斷方法主要有病毒的分離與鑒定方法[1，9]、血清學(xué)方法[4-5，10-11]、分子生物學(xué)方法[1，4，12]，其中病毒的分離與鑒定是確診該病的最好方法，血清學(xué)方法中的ELISA檢測已有商業(yè)化試劑，在分子生物學(xué)方面，目前德國FLI和我國的張永寧等均已針對SBV的S基因建立了施馬倫貝格病的熒光定量RT-PCR檢測方法[12-13]。

SBV屬于布尼亞病毒科（Bunyaviride）正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）辛波血清群（Simbu serogroup）。由于SBV與辛波血清群的沙門達(dá)病毒、薩蘇伯里病毒、道格拉斯病毒、赤羽病毒和艾羅病毒等親緣關(guān)系很近[1，14]，為了更好的建立一種敏感、特異的檢測方法，本研究選擇SBV S、M、L三基因同時(shí)開展焦磷酸測序研究，通過試驗(yàn)篩選最佳的檢測靶基因建立SBV焦磷酸測序檢測方法。通過序列比對分析，分別選擇SBV S、M、

L基因的保守區(qū)域利用焦磷酸測序儀攜帶的引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)測序?qū)Ｓ玫臄U(kuò)增引物（生物素標(biāo)記）和測序引物，并對PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，爭取以最少用量的反應(yīng)成分進(jìn)行試驗(yàn)，防止反應(yīng)體系中過多的生物素標(biāo)記引物或者其他反應(yīng)成分均會(huì)對后續(xù)試驗(yàn)造成影響，使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。以最佳的反應(yīng)體系擴(kuò)增梯度稀釋的重組質(zhì)粒，擴(kuò)增完畢以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示107-104拷貝/μL重組S基因質(zhì)粒均擴(kuò)增出了目的條帶，107-104拷貝/μL重組M基因質(zhì)粒均擴(kuò)增出了目的條帶，107-105拷貝/μL重組L基因質(zhì)粒均擴(kuò)增出了目的條帶，根據(jù)電泳檢測結(jié)果得出，S、M基因的擴(kuò)增效率較高，敏感性高，L基因的擴(kuò)增效率較差，因此，選擇S和M基因進(jìn)行后續(xù)的測序研究。取適量S和M基因的PCR產(chǎn)物上機(jī)進(jìn)行測序，反應(yīng)結(jié)束儀器自動(dòng)給出測序結(jié)果。其中107～104拷貝/μL重組S基因質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測得序列一致，均為：TAAGGGATGC ACCTGGGCCG ATGGTTATAC AATGTATCTT GGATTTGC，將此序列在網(wǎng)上進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果與SBV序列的一致性可達(dá)100%，但是該序列與道格拉斯病毒序列的一致性也為100%，因此通過該序列來達(dá)到病毒的鑒別診斷比較困難。重組M基因質(zhì)粒107-104拷貝/μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測得序列一致為：TGGAGAAAGC CTCTTTTCCA TTATTATCTA TG，將此序列在網(wǎng)上進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示序列一致性為100%的均為SBV，表明該序列的特異性較好，可以用作SBV基因序列水平上的精準(zhǔn)檢測。為進(jìn)一步驗(yàn)證M基因PCR擴(kuò)增引物的特異性，本研究以構(gòu)建的沙門達(dá)病毒、薩蘇伯里病毒、道格拉斯病毒、赤羽病病毒和艾羅病毒的重組質(zhì)粒為對照樣品，以pMD19-T-SBVM重組質(zhì)粒為陽性對照，以ddH2O為陰性對照進(jìn)行了特異性檢測，結(jié)果表明本研究所設(shè)計(jì)的SBV-M基因的PCR擴(kuò)增引物具有較好的特異性。通過上述試驗(yàn)可以得出，M基因無論在擴(kuò)增效率、敏感性和特異性方面，還是在測序結(jié)果上都取得了比較滿意的結(jié)果，因此將M基因作為焦磷酸測序檢測方法的靶基因。

應(yīng)用所建立的SBV-M基因的焦磷酸測序檢測方法檢測德國FLI實(shí)驗(yàn)室提供的SBV RNA樣品，將測序結(jié)果進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示與SBV序列一致性達(dá)到100%，因此可將樣品判斷為SBV感染。本研究所采用的焦磷酸測序技術(shù)不僅具有經(jīng)典Sanger DNA測序法的高精確性，還具有高通量、高自動(dòng)化、高效、簡單易行、省時(shí)省力等其他檢測技術(shù)不可比擬的優(yōu)點(diǎn)[15]，所建立的SBV-M基因的焦磷酸測序檢測方法在普通RT-PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，輔以基因序列水平上的目的片段測序，減少了由于RT-PCR敏感性高而出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，大大提高了檢測特異性[16]，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。

綜上，本研究建立了施馬倫貝格病毒基于RTPCR的焦磷酸測序檢測方法能夠從基因序列水平上對SBV進(jìn)行精準(zhǔn)檢測鑒定，為SBV的檢測提供了一種高通量、快速、靈敏、特異的精準(zhǔn)檢測技術(shù)，為施馬倫貝格病的檢疫提供了很好的技術(shù)儲(chǔ)備。

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Development of PCR-Pyrosequencing Assay for Detection of Schmallenberg Disease

Wang Caixia，Lin Xiangmei，Zhang Yongning，Lv Jizhou，F(xiàn)eng Chunyan，Yuan Xiangfen，Deng Junhua，Wu Shaoqiang

（The Institute of Animal Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029）

To meet the rapid，accurate and high throughput detection of Schmallenberg disease，a pyrosequencing assay was developed in combination with PCR amplif cation of the target sequences. Pyrosequencing specif c primers of SBV segments of S，M and L were separately designed targeting the conserved region of the sequence using primer designer software PyroMark Q96ID. PCR-pyrosequencing assay of SBV S，M，L were established with the recombinant plasmid of SBV S，M，L as template，and the sequences were determined by PyroMarkTMID System. SBV RNA presented by FLI was used as positive material to validate the developed PCR-pyrosequencing assay. Comparing the electrophoresis result of PCR amplicons，the result of pyrosequencing assay and the result of specif city detection，the pyrosequencing assay targeting M gene was the best one among the assays targeting S，M and L genes. The developed SBV-M pyrosequencing assay was further verif ed by using the SBV positive RNA material as template by means of Blast analysis of obtained sequence online. Results showed that the developed pyrosequencing assay could identify SBV. The method was of high sensitivity，good stability and high specif city，and could be used as an accurate detection method for Schmallenberg disease .

Schmallenberg disease； polymerase chain reaction； pyrosequencing； identif cation； detection

S852.659.5；S858.23

：A

：1005-944X（2014）10-0057-06