HPLC法測定透骨消痛膠囊中芍藥苷的含量

倪立堅(jiān)，嚴(yán)錦賢，鄭笈，劉獻(xiàn)祥

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建福州350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122）

透骨消痛膠囊由腫節(jié)風(fēng)、巴戟天、白芍、川芎4味中藥組成，用于治療骨性關(guān)節(jié)炎（OA）。白芍能滋陰養(yǎng)血，柔肝止痛，與川芎配合，兼顧活血、養(yǎng)血，起到疏肝、柔肝并舉的效果。芍藥苷是白芍中最重要的成分，本實(shí)驗(yàn)通過建立高效液相色譜法測定透骨消痛膠囊中芍藥苷含量的方法，達(dá)到控制其質(zhì)量的目的。

1 儀器與試劑

1.1 儀器1100型安捷倫高效液相色譜儀；超純水器（Mililpore）；超聲波發(fā)生器（奧特寶恩斯儀器有限公司）。

1.2 對(duì)照品及試劑芍藥苷對(duì)照品（中國藥品生物檢定所提供，批號(hào)：110736-200424）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Novapak C18（250 mm×4.6 mm，4 μm）（大連依特利科學(xué)儀器有限公司裝填）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸（25∶75）；檢測波長：230 nm；柱溫：室溫；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL（自動(dòng)進(jìn)樣）。理論塔板數(shù)：按芍藥苷計(jì)算不得低于2 000。在以上試驗(yàn)條件下試驗(yàn)，采用DAD檢測器檢測，結(jié)果表明樣品和對(duì)照品光譜圖完全一致，芍藥苷在波長230 nm處有最大吸收，同時(shí)參考文獻(xiàn)資料將檢測波長定為230 nm。見圖1。

圖1 芍藥苷光譜圖

2.2 提取方法的選擇

2.2.1 提取溶劑的考察取樣品0.8 g，分別精密加入甲醇、稀乙醇溶劑25 mL超聲處理30 min，取續(xù)濾液進(jìn)樣，測定2種成分的峰質(zhì)比。結(jié)果表明：用稀乙醇提取的2種成分含量較高。見表1。

表1 不同溶劑提取樣品中2種成分的峰質(zhì)比

2.2.2 提取方法的選擇取樣品0.8 g，精密加入稀乙醇溶劑25 mL分別超聲處理30、45、60 min，及加熱回流30、45、60 min，取續(xù)濾液進(jìn)樣，測定2種成分的峰質(zhì)比。結(jié)果表明：采取回流提取的方法比超聲提取2種成分效果好，回流30 min能將樣品中的2種成分提取完全。見表2。

綜合以上結(jié)果，將提取方法定為用稀乙醇回流30 min。

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液制備取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備按2.2.2項(xiàng)下回流法制得供試品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液制備取除白芍外處方中藥，制作空白樣品，并按供試品溶液的制備制得陰性樣品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn)分別吸取芍藥苷對(duì)照品溶液、透骨消痛膠囊供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。陰性樣品溶液在與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處，無色譜峰出現(xiàn)，見圖2～圖4，表明方中其它各味藥材不干擾芍藥苷的測定。

表2 不同提取方法和提取時(shí)間測定樣品中芍藥苷峰質(zhì)比

圖2 芍藥苷對(duì)照品

圖3 供試品色譜圖

圖4 白芍陰性樣品色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察配制不同濃度的芍藥苷對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y＝15.945x－60.947，r＝0.9999。結(jié)果表明：芍藥苷在5.3952～337.2 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液室溫下放置，分別于0、3、7、10 h進(jìn)樣，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定芍藥苷峰面積，RSD為1.18%。表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取樣品6份，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)行6次平行測定，測得芍藥苷平均含量為4.87 mg/g，RSD為1.27%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 回收率試驗(yàn)取已知含量的同一批號(hào)供試品9份，分成3組，采用加樣回收試驗(yàn)，每組分別精密加入3個(gè)不同濃度的芍藥苷對(duì)照品，照供試品溶液制備方法制備9份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥苷平均回收率為104.3%，RSD為1.68%。表明該方法具有較好的加樣回收率。

3 討論

透骨消痛膠囊是根據(jù)劉獻(xiàn)祥教授用于治療骨性關(guān)節(jié)炎的臨床經(jīng)驗(yàn)方研制而成的中藥制劑［1-2］。具有補(bǔ)腎柔肝、活血祛風(fēng)的功效，用于肝腎虧虛型OA，療效確切［3］。癥見關(guān)節(jié)隱隱作痛或腫脹，屈伸不利，行走不便，腰部酸軟，舌淡紅苔薄白，脈沉或細(xì)。方由巴戟天、杭白芍、川芎等組成。

透骨消痛膠囊是以“腎主骨”、“肝主筋”等中醫(yī)理論為指導(dǎo)，針對(duì)OA病機(jī)及治療認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上組方。以補(bǔ)腎作為治療OA的根本法則并佐以四要：①補(bǔ)腎要養(yǎng)肝，肝腎同源，肝腎同健痹自殲（白芍養(yǎng)血柔肝以助固本）；②補(bǔ)腎要活血；③補(bǔ)腎要止痛，痛解痹自停（白芍能柔肝止痛）；④補(bǔ)腎要祛邪。此外，川芎和白芍兩者合用，活血、養(yǎng)血兼顧，疏肝、柔肝并舉，使其活血而不傷正，疏肝開郁而不損肝陰。

芍藥苷為白芍中最重要的成分，本文通過建立高效液相色譜法測定透骨消痛膠囊中芍藥苷的含量來衡量白芍藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，并進(jìn)行科學(xué)方法考察，結(jié)果較為滿意，可以作為透骨消痛膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

［1］ 林木南，劉獻(xiàn)祥.透骨消痛方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎30例［J］.福建中醫(yī)藥，2005，36（4）：15-16.

［2］ 吳追樂，許惠鳳，李西海，等.透骨消痛膠囊含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，22（4）：24-27.

［3］ 唐勇，姜杰，孟輝，等.補(bǔ)腎益氣行血方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎44例［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005，16（9）：902-903.