楊 穎 龍華君 劉 雨 帥文昊 張珊珊 胡國恒

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

腦缺血再灌注損傷（CIRI）是指腦組織缺血一段時間后，血流再次恢復(fù)，而對缺血區(qū)腦組織造成更加嚴(yán)重的損傷，其表現(xiàn)為神經(jīng)細胞損害和腦功能障礙的進一步加重。研究表明，缺血再灌注損傷的機制與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子反應(yīng)、細胞凋亡和自噬等因素有關(guān)，其中B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）作為一種至關(guān)重要的內(nèi)源性神經(jīng)保護因子，它的表達與腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元的存活有著密不可分的聯(lián)系［1-2］。陳芬芳等［3］研究證實Bcl-2可以通過多種途徑干預(yù)細胞凋亡，其表達能影響細胞的存活與滅亡。柔肝通絡(luò)湯的組成遵循“肝腎同源、從腎治腦、腎腦同治”理論，總結(jié)多年的臨床經(jīng)驗教訓(xùn)，對臨床治療缺血性腦卒中起到了顯著療效。本研究旨在探討不同劑量的柔肝通絡(luò)湯對腦缺血再灌注損傷大鼠Bcl-2蛋白表達的影響，研究柔肝通絡(luò)湯干預(yù)腦缺血再灌注損傷的作用機制，為中醫(yī)臨床方藥的應(yīng)用推廣提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康雄性Sprague-Dqwley（SD）大鼠78只，體質(zhì)量250～300 g，鼠齡為18月，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2015-0003，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥研究院中藥研究所SPF級實驗室，室溫18～20℃，濕度65%～70%，每日喂水喂食。

1.2 試藥與儀器

1）藥物：柔肝通絡(luò)湯組方：桑椹15 g，制首烏15 g，枸杞子 30 g，丹參 30 g，當(dāng)歸尾 10 g，赤芍 10 g，山楂15 g，葛根30 g，地龍10 g，均來自湖南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。上述藥材煎煮2次，第1次加水量為500 mL，第2次為300 mL，均煎至150 mL；2次煎液去渣濾凈后混合，以文火煎至黏稠狀（內(nèi)含生藥2 g/mL），冷藏。2）試劑及儀器：MCAO線栓（北京西濃生物科技）；常規(guī)生物化學(xué)實驗試劑（上海國藥生物）；中性樹膠（美國Sigma）；PBS（谷歌生物）；枸櫞酸鹽緩沖液、蘇木素、伊紅（美國Wellbio）；免疫組化二步法試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋）；恒溫箱（北京六一）；包埋機（武漢俊杰電子）；顯微鏡（美國Motic）。

1.3 造模及分組

1）動物分組：按照體質(zhì)量將大鼠進行分層，然后遵循隨機數(shù)字表法將其分成假手術(shù)組（6只大鼠）、模型組（18只大鼠）、柔肝通絡(luò)湯高劑量組（18只大鼠）、柔肝通絡(luò)湯中劑量組（18只大鼠）、柔肝通絡(luò)湯低劑量組（18只大鼠），其中模型組及柔肝通絡(luò)湯各劑量組再根據(jù)腦缺血再灌注后3、12、24 h時間點分3個亞組（每個亞組6只）。2）模型制備：參照改良Longa法將模型組及柔肝通絡(luò)湯高劑量、柔肝通絡(luò)湯中劑量、柔肝通絡(luò)湯低劑量組大鼠制成大腦中動脈堵塞（MCAO）模型，MCAO線栓從大鼠的右側(cè)頸總動脈插入，由頸內(nèi)外動脈分叉部計（18.5±0.5）mm，插入大腦前動脈，以阻斷大腦中動脈血流；假手術(shù)組則將栓線插入15 mm以內(nèi)，不能完全阻斷大腦中動脈，其余步驟參照模型組。然后記錄阻斷時間，縫合傷口，外留線栓10mm，在2 h后輕拔出線栓約10 mm，即再灌注模型建立完成。模型建立成功的3項指標(biāo)為：（1）提尾時左前肢內(nèi)收屈曲；（2）同側(cè)Homer征；（3）爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。最后篩除不成功的動物模型。

1.4 干預(yù)方法

依照人和動物體表面積換算的等效劑量比率表，柔肝通絡(luò)湯高劑量、柔肝通絡(luò)湯中劑量、柔肝通絡(luò)湯低劑量組分別于造模前7 d灌胃相應(yīng)劑量的柔肝通絡(luò)湯湯劑（2.8、1.4、0.7 g/100 g生藥含量），假手術(shù)組、模型組均用1.4 g/100 g蒸餾水灌胃，均連續(xù)預(yù)處理灌胃1周，每天1次。末次灌胃給藥后30 min，腹腔麻醉處死，將腦組織取出。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 神經(jīng)功能缺損程度評分 按再灌注3、12、24 h 3個時間點分別進行Longa神經(jīng)功能缺損程度評分。0分：完全沒有神經(jīng)功能損傷的癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)身體傾倒；4分：失去意識，無法自主行走。

1.5.2 梗死側(cè)腦組織觀察 將梗死側(cè)腦組織常規(guī)固定，石蠟包埋切片，梯度酒精脫水，蘇木素染色，水洗，用1%鹽酸酒精分化，水洗，伊紅染色，水洗，梯度酒精脫水至透明干燥，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察、攝像。

1.5.3 梗死側(cè)腦組織Bcl-2蛋白免疫組化染色（SP法） 將梗死側(cè)腦組織常規(guī)固定，石蠟包埋切片，梯度酒精脫水，蒸餾水洗片3 min×2，高溫高壓條件下抗原修復(fù)，切片后加3% H2O2甲醇液，在室溫下反應(yīng)10 min，PBS洗片 3 min×3，甩去，加封閉型動物血清 50 μL，37℃下孵育10 min，甩去，加一抗50 μL，4℃下孵育18 h，PBS洗片5 min×3，甩去，加生物素標(biāo)記二抗50 μL，37 ℃下孵育10 min，PBS洗片3 min×3，甩去，加鏈親和素-過氧化物酶溶液50 μL，37℃下孵育10 min，PBS洗片5 min×3，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染10 s，常規(guī)脫水、透明、封片。采用光學(xué)顯微鏡對梗死側(cè)海馬區(qū)腦組織進行成像，每張切片選擇5個400倍視野范圍，并在每個視野范圍內(nèi)對Bcl-2染色陽性細胞進行觀察（胞漿或胞核有棕色顆粒者），Image-Pro Plus軟件計算出每個視野內(nèi)的Bcl-2陽性表達細胞的平均光密度（OD值），OD值越大則表明Bcl-2陽性細胞表達越多。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，滿足正態(tài)分布和方差齊性采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗；若不滿足正態(tài)分布或方差齊性，采用非參數(shù)秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分

見表1。假手術(shù)組大鼠未表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在不同時間點均表現(xiàn)出明顯的肢體神經(jīng)缺損癥狀（P＜0.01）。與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯高劑量組大鼠在不同時間點的神經(jīng)功能缺損程度評分均有顯著下降（P＜0.05），柔肝通絡(luò)湯中、低劑量組不同時間點的神經(jīng)功能缺損程度評分有所下降，在再灌注3 h時差異明顯（P＜0.05）。柔肝通絡(luò)湯各劑量組間比較，同一時間點，神經(jīng)功能缺損程度評分隨柔肝通絡(luò)湯劑量的降低而逐漸升高，柔肝通絡(luò)湯高劑量組評分最低，柔肝通絡(luò)湯低劑量組評分最高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。模型組與柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組的神經(jīng)功能缺損程度評分在腦缺血再灌注3 h時最低，12 h時上升，24 h時最高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點的神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠不同時間點的神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

注：與模型組同時期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組同時期比較，#P＜0.05。下同。

組別假手術(shù)組模型組柔肝通絡(luò)湯高劑量組柔肝通絡(luò)湯中劑量組柔肝通絡(luò)湯低劑量組n 6 6 6 6 6再灌注3 h 0 2.00±0.63#1.17±0.43*1.33±0.52*1.33±0.63*再灌注12 h 0 2.33±0.52#1.50±0.55*1.88±0.25 2.00±0.41再灌注24 h 0 2.80±0.41#2.00±0.63*2.33±0.52 2.42±0.55

2.2 各組大鼠梗死側(cè)腦組織觀察

圖1 各組大鼠不同時間點海馬區(qū)腦組織觀察（HE染色，400倍）

見圖1。假手術(shù)組：正常細胞層次明了，結(jié)構(gòu)完好，細胞胞漿和胞核染色均勻，細胞核位于中間位置，核仁清晰可見。模型組：較假手術(shù)組而言，正常細胞數(shù)量減少，神經(jīng)元變性、壞死加重，細胞形態(tài)各異，胞體變小，胞核固縮深染，核仁不易見；細胞間隙擴大，大量空泡樣改變，血管擴張充血明顯。細胞損傷程度以再灌注3 h時為輕，隨著時間的推移，細胞損傷逐步加重，在24 h時最為嚴(yán)重。較模型組相比，柔肝通絡(luò)湯各組的神經(jīng)細胞損傷情況得以減輕，其中柔肝通絡(luò)湯高劑量組大鼠的神經(jīng)元細胞形態(tài)較為完整，正常細胞數(shù)量較多，細胞固縮程度較輕，仍能清晰區(qū)分胞膜和核仁，細胞空泡樣改變較少。而柔肝通絡(luò)湯中、低劑量組大鼠腦組織損傷程度較柔肝通絡(luò)湯高劑量組有所加重，以柔肝通絡(luò)湯低劑量組最為嚴(yán)重。柔肝通絡(luò)湯各劑量組大鼠在再灌注3 h時細胞損傷程度最輕，隨著時間的推移，神經(jīng)元細胞變性、壞死逐漸加重，24 h時最為嚴(yán)重。

2.3 各組大鼠梗死側(cè)腦組織Bcl-2陽性細胞表達比較

見表2。假手術(shù)組大鼠梗死側(cè)海馬區(qū)的Bcl-2表達最少，而模型組和柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組均有Bcl-2蛋白的散在分布。模型組的Bcl-2蛋白表達明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組Bcl-2蛋白在各時間點的表達均顯著增高（P＜0.01），且隨柔肝通絡(luò)湯劑量的增加而增加，柔肝通絡(luò)湯高劑量組中Bcl-2表達最高，柔肝通絡(luò)湯低劑量組中Bcl-2表達最低。缺血再灌注3 h時，各組大鼠的Bcl-2表達最少，隨著時間的推移，12 h時有所增加，24 h時達到最高值，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠不同時間點的Bcl-2陽性細胞表達比較（OD值，±s）

表2 各組大鼠不同時間點的Bcl-2陽性細胞表達比較（OD值，±s）

組別假手術(shù)組模型組柔肝通絡(luò)湯高劑量組柔肝通絡(luò)湯中劑量組柔肝通絡(luò)湯低劑量組n 6 6 6 6 6再灌注3 h-0.036±0.010#0.111±0.004**0.102±0.005**0.070±0.007**再灌注12 h 0.008±0.004 0.054±0.010#0.126±0.006**0.111±0.006**0.090±0.006**再灌注24 h-0.082±0.006#0.127±0.007**0.117±0.004**0.103±0.006**

3 討論

腦缺血再灌注損傷的機制與能量代謝失衡、興奮性毒性、炎癥因子釋放、自由基損傷、細胞內(nèi)Ca2+超載、凋亡相關(guān)基因激活等因素有關(guān)［4-6］，這些病理過程又相互作用、互為因果，最終造成細胞死亡［7］。例如，腦組織缺血缺氧后，生成過量的氧自由基，直接誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡；能量代謝失衡和鈣離子超載都可由線粒體損傷引起，而這些又會促進細胞的凋亡；缺血缺氧可能激活凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3等）的表達，進而影響凋亡機制的進展。研究表明，Bcl-2蛋白作為至關(guān)重要的抗凋亡蛋白，可影響腦缺血再灌注損傷后部分神經(jīng)細胞的存活［8］，它的特點是其三維空間結(jié)構(gòu)所形成的疏水凹槽除了能結(jié)合含有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白影響細胞凋亡外，還能通過多種機制調(diào)控氧化應(yīng)激，從其他途徑誘導(dǎo)細胞凋亡；此外，定位于神經(jīng)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Bcl-2可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定狀態(tài)，促進鈣離子的快速釋放，從而誘導(dǎo)細胞凋亡［9］。但又有實驗研究表明［10］，在缺血再灌注損傷的早期治療階段，有效運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)、病毒載體、針灸療法和神經(jīng)保護制劑等積極的治療方法，可以提高Bcl-2蛋白的表達，從而抑制凋亡的活化，促進腦組織神經(jīng)元修復(fù)。近年來，關(guān)于中醫(yī)藥抑制細胞凋亡的研究日益增多，如銀杏葉提取物［11］對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用，其機制可能與提高腦組織中Bcl-2的表達，降低腦組織中Bax的表達有關(guān)；燈盞花素［12］對腦缺血再灌注損傷后的細胞凋亡起到了抑制作用，其減輕腦損傷的作用可能與增加c-Bcl-2表達，減少c-fos和Caspase3的表達有關(guān)；丹參［13］對腦缺血后腦組織具有神經(jīng)保護作用，其機制可能與減少腦缺血后ICE的表達，增加Bcl-2的表達有關(guān)；補陽還五湯［14-15］能顯著減少缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡，減少腦梗死面積，其影響因素可能與增加Bcl-2/Bax比值有關(guān)。

本實驗研究結(jié)果顯示，模型組大鼠在腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺損程度評分明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），且神經(jīng)元細胞損傷更為明顯，其損傷程度隨時間的推移而持續(xù)加重。柔肝通絡(luò)湯各劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損程度評分明顯低于模型組（P＜0.05），均能明顯減輕神經(jīng)元細胞損傷，其改善程度呈劑量依賴關(guān)系，其中柔肝通絡(luò)湯高劑量的治療效果最明顯，說明柔肝通絡(luò)湯能有效緩解大鼠腦缺血再灌注腦損傷，降低肢體神經(jīng)功能缺損程度。在Bcl-2蛋白表達方面，模型組高于假手術(shù)組（P＜0.01），其中再灌注3 h時Bcl-2蛋白表達較少，且Bcl-2蛋白表達隨時間的推移持續(xù)增加，24 h時達到最高，說明腦缺血再灌注損傷可持續(xù)激活抗凋亡基因Bcl-2蛋白。柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組與模型組相比，各時間點的Bcl-2表達均明顯升高（P＜0.01），且隨著柔肝通絡(luò)湯劑量的增加而增加，說明不同劑量的柔肝通絡(luò)湯均能上調(diào)Bcl-2蛋白的表達。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性腦卒中的病位在腦髓血脈，而腦髓因腎而生，髓海之病，其本源在腎，當(dāng)以補腎為主；乙癸同源，精血互生，陰血虧虛首責(zé)為肝腎虧虛；髓海血脈為病，脈絡(luò)不暢，氣血停滯，瘀血內(nèi)生，而腦髓不得濡養(yǎng)，故其病機關(guān)鍵為陰虛血瘀，因此治療缺血性中風(fēng)應(yīng)當(dāng)以養(yǎng)肝補腎為主，兼以活血通絡(luò)。柔肝通絡(luò)湯方中以桑椹子為君，入心、肝、腎經(jīng)，滋陰補血；制首烏補益精血，枸杞子滋補肝腎，共為臣藥，助君補肝腎之陰；赤芍、丹參、當(dāng)歸尾等皆入肝經(jīng)而活血散瘀力強，葛根味辛能行以助活血化瘀，地龍善走竄可通經(jīng)活絡(luò)，山楂通行氣血，和胃助運，共為佐藥。臨床應(yīng)用［16］已證明柔肝通絡(luò)湯能有效改善患者神經(jīng)功能缺損，縮短康復(fù)時間，提高臨床療效。本課題組前期基礎(chǔ)研究［17-18］也證實本方能降低MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分，縮減腦梗死面積，降低凋亡細胞數(shù)，增加活神經(jīng)元數(shù)。本研究提示柔肝通絡(luò)湯能使腦缺血再灌注損傷后大鼠Bcl-2蛋白表達明顯升高，神經(jīng)功能缺損程度評分明顯降低，腦組織神經(jīng)細胞損傷明顯減輕，說明該方具有腦神經(jīng)保護的作用。然而，由于Bcl-2蛋白生物學(xué)特性的復(fù)雜性和參與機制的多樣性，柔肝通絡(luò)湯對抗凋亡蛋白Bc1-2的調(diào)控作用及其信號傳導(dǎo)途徑尚待進一步研究。