基于流式微球分析技術的超高靈敏度蛋白激酶活性分析

蛋白激酶引發(fā)的蛋白質(zhì)磷酸化在細胞信號轉導過程中發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用。研究表明，眾多的人類疾病和蛋白激酶的活性異常密切相關，蛋白激酶也因而成為治療癌癥、炎癥和其它免疫調(diào)控紊亂等復雜性疾病的重要藥物靶點，開發(fā)、篩選小分子蛋白激酶活性抑制劑是當前新藥研發(fā)的重要方向。因此，建立操作簡單、成本低廉、靈敏度高的蛋白激酶活性檢測方法是實現(xiàn)以蛋白激酶為靶點進行疾病診斷及新藥開發(fā)的先決條件。傳統(tǒng)激酶活性分析方法主要是依賴放射性32P標記或?qū)μ囟姿峄被嵛稽c具有特異性識別作用的親和抗體來區(qū)分底物肽/蛋白是否被磷酸化。這兩類方法都存在自身固有缺陷，如放射性標記會對人體以及環(huán)境產(chǎn)生危害，而磷酸化親和抗體則受到制備復雜、成本高、操作繁瑣等因素制約，因此開發(fā)非放射性、無需采用識別抗體的蛋白激酶活性分析方法仍是相關領域的研究熱點。

最近，陜西師范大學化學化工學院劉成輝研究組提出了一種新穎的基于流式微球分析技術的蛋白激酶活性分析方法，以極為簡單的操作實現(xiàn)了蛋白激酶A（PKA）的超高靈敏度檢測，相關成果發(fā)表在Anal. Chem.， 2013， DOI： 10.1021/ac4024457。該研究組首先對多孔SiO2微球進行了化學修飾，使其表面包覆一層Zr4+離子層，而Zr4+能夠特異性識別并捕獲磷酸化多肽，從而克服了常規(guī)方法對放射性標記或親和抗體的依賴。在磷酸化反應體系中，如果存在蛋白激酶（以PKA為例），則熒光素標記的底物肽將被磷酸化從而可被Zr4+修飾的SiO2微球識別并捕獲到微球表面，而未磷酸化的熒光多肽不會與微球作用，因此，體系中激酶的活性越高，則微球表面富集的磷酸化多肽越多，微球的熒光信號越強，該研究創(chuàng)新性采用流式細胞儀實現(xiàn)了微球熒光信號的靈敏、快速分析。

由于Zr4+修飾的SiO2多孔微球比表面積大，可在微球表面快速、高選擇性、高密度地富集磷酸化熒光底物肽，使熒光信號高度集中；同時，流式細胞儀兼具散射、熒光等多信號參數(shù)同時輸出功能，可自動區(qū)分微球熒光信號與溶液中游離的熒光信號，因此該方法無需將微球與未磷酸化的游離熒光肽進行分離，將蛋白激酶磷酸化反應體系與Zr4+修飾的SiO2微球混合后即可直接進行流式分析，因此該方法在保證了高靈敏度的同時，極大地簡化了檢測步驟。隨著小型便攜式流式檢測儀的逐步推廣以及多孔板高通量進樣模式在流式分析技術中的逐漸成熟，該方法在以蛋白激酶為靶點的疾病診斷及藥物篩選領域展現(xiàn)出了良好的應用前景。