劉麗珠 劉薇 樊琳

[摘要] 目的 探討黃芪多糖（APS）影響大鼠腦卒中后抑郁（PSD）的可能機(jī)制。 方法 先采用曠場實驗篩選出合格的Wistar大鼠48只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白對照組、模型對照組、APS低劑量組和APS高劑量組，每組12只。除空白對照組外，其他三組均采用線栓法構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血模型，并于術(shù)后經(jīng)慢性不可預(yù)見性應(yīng)激法（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的方法建立大鼠PSD模型。術(shù)后APS低劑量組和APS高劑量組按200 mg/（kg·d）和400 mg/（kg·d）灌胃給予APS溶液治療4周，模型對照組和空白對照組灌胃給予等體積生理鹽水。治療結(jié)束后檢測海馬CA1區(qū)組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）蛋白及其基因表達(dá)并結(jié)合行為學(xué)實驗和電生理實驗分析APS對大鼠PSD的影響。 結(jié)果 與模型對照組比較，膜片鉗記錄顯示，APS低劑量組和APS高劑量組CA1區(qū)自發(fā)性動作電位（AP）和群峰電位（PS）電壓均明顯降低，NF-κB蛋白和mRNA低表達(dá)，而PPAR-γ蛋白及mRNA明顯高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;糖水?dāng)z取實驗顯示APS低劑量組和APS高劑量組糖水?dāng)z取量較模型對照組明顯增多，水迷宮實驗顯示兩組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，且穿臺次數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。APS高劑量組上述各指標(biāo)變化較APS低劑量組更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 APS可能通過抑制NF-κB信號通路的磷酸化反應(yīng)，穩(wěn)定腦海馬CA1區(qū)AP和PS電壓而發(fā)揮對PSD的治療作用。

[關(guān)鍵詞] 大鼠;黃芪多糖;腦卒中后抑郁;電位;NF-κB信號通路;磷酸化

[中圖分類號] R743? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（a）-0011-04

[Abstract] Objective To investigate the effects and possible mechanism of astragalus polysaccharide （APS） on post-stroke depression （PSD） in rats. Methods Wistar rats were screened by open field test， and a total of 48 eligible rats were divided into blank control group， model control group， APS low dose group and APS high dose group according to random number table method， with 12 rats in each group. The model of focal cerebral ischemia was established using suture-occluded method in all groups except the blank control group， and the rat PSD model was established by isolation housing combined with chronic unpredictable stress method （CUMS）. Post-surgery， rats received treatment of APS 200 mg/（kg·d） （APS low dose group）， APS 400 mg/（kg·d） （APS high dose group） and equal volume of saline （model control group and blank control group） for 4 weeks by gavage. Results from the behavioral and electrophysiology experiments， and the level of protein and gene expressions of nuclear factor-κB （NF-κB） and peroxisome proliferator-activated receptor-gamma （PPAR-γ） in hippocampal CA1 region were analyzed to determine the effect of APS on PSD in rats. Results Compared with the model control group， the APS low dose group and the APS high dose group showed significantly lower spontaneous action potential （AP） and group peak potential （PS） voltages in the CA1 region by patch clamp recordings， significantly lower NF-κB protein and mRNA expression and significantly higher PPAR-γ protein and mRNA expression， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The saccharification water intake experiment showed that the sucrose intake of the two APS dose groups were significantly higher than those of the model control group， the water maze test showed that the escape latency of the rats in the two APS dose groups were significantly shortened and number of platform crossings were significantly increased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The changes of the above parameters in the APS high dose group were more obvious than those in the APS low dose group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion APS may play a therapeutic role in PSD by inhibiting the phosphorylation of NF-κB signaling pathway and stabilizing the AP and PS voltages in the hippocampal CA1 region.

[Key words] Rat; Astragalus polysaccharide; Post-stroke depression; Potential; NF-κB signaling pathway; Phosphorylation

腦卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）屬于腦卒中后繼發(fā)性心境障礙性疾病，具有發(fā)病率、致殘率、死亡率高的臨床特點[1-2]。研究表明，腦卒中2周后27.47%的患者會出現(xiàn)不同程度的抑郁，PSD會延遲卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)，并可能增加卒中復(fù)發(fā)率和病死率[3]。丘腦、海馬、基底節(jié)、額葉及顳葉均為PSD好發(fā)病灶[4-5]。研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）磷酸化反應(yīng)與PSD的發(fā)生相關(guān)[6-7]。抑制NF-κB信號通路磷酸化反應(yīng)可減輕PSD模型大鼠抑郁癥狀，電刺激可顯著降低其前額葉皮層中的NF-κB[8]。由此可見，NF-κB活性與PSD密切相關(guān)[9]。有動物實驗表明，降低大鼠海馬CA1區(qū)自發(fā)性動作電位（AP）和群峰電位（PS）電位電壓后PSD模型大鼠的抑郁癥狀明顯好轉(zhuǎn)[10]。上述諸多研究均說明，糾正腦海馬CA1區(qū)異常放電，抑制NF-κB信號通路磷酸化反應(yīng)可能有利于PSD的康復(fù)。而黃芪多糖（APS）具有良好的營養(yǎng)神經(jīng)作用，對改善不同類型的神經(jīng)損傷、恢復(fù)神經(jīng)功能具有明顯促進(jìn)作用[11]。因此，系統(tǒng)研究APS對NF-κB信號通路及海馬CA1區(qū)電活動的影響對開發(fā)新藥用于臨床治療PSD有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級健康雄性Wistar大鼠，月齡38～42 d，體重170～190 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，在湖北省十堰市太和醫(yī)院（以下簡稱“我院”）生命科學(xué)研究所實驗室飼養(yǎng)并進(jìn)行實驗，實驗動物設(shè)施使用證：SYXK（鄂）2016-0031，實驗動物質(zhì)量合格證：SCXK（鄂）2016-008。將采用曠場實驗篩選合格的48只Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組、APS低劑量組和APS高劑量組，每組12只。實驗中遵守3R原則，給予動物人道關(guān)懷并使之充分享受動物福利，福利倫理審查證號：湖北醫(yī)藥學(xué)院動（福）第2018-1號。

1.2 藥品與設(shè)備

APS（北京索萊寶科技有限公司，批號：SA9790）;Morris水迷宮（上海洛維生物科技有限公司）;Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（版本：XR-XM101，成都泰盟軟件有限公司）;過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）和NF-κB試劑盒（上海超研生物科技有限公司，批號：H1425、H1427）。

1.3 大鼠PSD模型建立與治療

除空白對照組外，模型對照組、APS高劑量組和APS低劑量組均采用線栓法構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血模型，術(shù)后3周內(nèi)每天隨機(jī)選取以下應(yīng)激性刺激中的2種（禁食17 h，禁水17 h，傾斜鼠籠45° 17 h，濕籠21 h，4℃冰水游泳5 min，水平高速振蕩5 min，夾尾1 min，夜間燈光照射、白天暗室使動物晝夜活動顛倒）并結(jié)合孤養(yǎng)的方法建立大鼠PSD模型[12]。利用大鼠對糖水嗜好的特點模擬人類的興趣感，糖水飲用量下降則反映出受試動物內(nèi)源性抑郁核心癥狀即快感缺失，3周后以大鼠糖水消耗量逐步降低、探究性和自發(fā)性活動減少、對外界不可預(yù)知刺激的被動躲避缺陷為造模成功標(biāo)準(zhǔn)[13]。本研究中，參考人與動物體表換算公式計算得出大鼠的用藥劑量為200～400 mg/（kg·d）。APS高劑量組和APS低劑量組分別用200 mg/（kg·d）和400 mg/（kg·d）APS灌胃（1次/d），空白對照組和模型對照組等量生理鹽水灌胃作為對照（1次/d），四組大鼠共治療4周。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 行為學(xué)及學(xué)習(xí)能力觀察? 治療結(jié)束后，采用糖水?dāng)z取實驗觀察大鼠抑郁行為;采用Morris水迷宮實驗評價大鼠學(xué)習(xí)能力。利用Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)記錄和分析各組大鼠進(jìn)入（穿越）次數(shù)和逃避潛伏期以評價大鼠學(xué)習(xí)能力。越臺次數(shù)越多、逃避潛伏期越短則提示所試動物學(xué)習(xí)和記憶能力提高。

1.4.2 膜片鉗技術(shù)檢測海馬CA1區(qū)AP和PS電壓? 斷頭處死大鼠后迅速取出腦組織，用振動切片機(jī)連續(xù)切成腦薄片（300 μm）。然后將腦薄片置于37℃飽和人工腦脊液中孵育1 h，孵育后用膜片鉗放大器記錄腦薄片CA1區(qū)AP和PS電壓。

1.4.3 Western blot檢測海馬CA1區(qū)腦組織NF-κB及PPAR-γ水平? 取大鼠海馬CA1區(qū)腦組織制成組織勻漿液，離心力調(diào)到3000 g，離心半徑為10 cm，離心15 min，取上清提取總蛋白，SDS分離，PVDF脫膜。加兔抗人NF-κB抗體，用封閉液將一抗按1∶5000稀釋，將膜與一抗共孵育，然后4℃過夜。用TBST洗膜，共2次（10 min），然后用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗（1∶3000），將稀釋后的二抗與膜共同孵育45 min。TBST洗膜，共4次（15 min）;采用HRP-ECL化學(xué)發(fā)光法發(fā)光顯影，然后用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行信號分析，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白產(chǎn)物相對量。PPAR-γ檢測步驟同上。

1.4.4 RT-PCR檢測海馬CA1區(qū)腦組織NF-κB及PPAR-γ的mRNA水平? ?用DNAMAN引物設(shè)計軟件設(shè)計引物序列，其中NF-κB mRNA上游引物：5′-AGACACTCCAGCTCCGTGCTAC-3′，下游引物：5′-GATC-GCGGTGGTACGTGCG-3′。PPAR-γ mRNA上游引物：5′-AGCCACTCCGAGTACATCTTGC-3′，下游引物：5′-ATCTCTAACATCAGGTGTC-3′。GAPDH上游引物：5′-ACCTCGGATCCGTGCGATGTAC-3′，下游引物：5′-A-GTACCTCTCGCCTACTAC-3′。RNA抽提試劑盒提取腦組織標(biāo)本總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對NF-κB和PPAR-γ基因進(jìn)行半定量分析。以NF-κB和PPAR-γ灰度值/GAPDH灰度值表示NF-κB mRNA和PPAR-γ mRNA的相對值（/GAPDH）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件處理實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間檢驗先進(jìn)行多因素方差分析，符合正態(tài)分布的組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，不符合正態(tài)分布的組間比較采用校正LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療后四組NF-κB、PPAR-γ的蛋白及mRNA相對表達(dá)值比較

與空白對照組比較，模型對照組NF-κB蛋白及mRNA均高表達(dá)，而PPAR-γ蛋白及mRNA均低表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與模型對照組比較，治療后APS低劑量組和APS高劑量組PPAR-γ蛋白及mRNA顯著升高，NF-κB蛋白及mRNA顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;與APS低劑量組比較，APS高劑量組PPAR-γ及NF-κB的蛋白及mRNA水平變化更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

表1? ?治療后四組NF-κB、PPAR-γ的蛋白及mRNA相對表達(dá)值

比較（x±s）

注：與空白對照組比較，aP < 0.05;與模型對照組比較，bP < 0.05;與APS低劑量組比較，cP < 0.05;PPAR-γ：過氧化物酶體增殖物激活受體-γ;NF-κB：核轉(zhuǎn)錄因子-κB;APS：黃芪多糖

2.2 治療后四組海馬CA1區(qū)AP、PS電壓變化比較

與空白對照組比較，模型對照組海馬CA1區(qū)AP、PS電壓明顯升高（P < 0.05）。與模型對照組比較，APS低劑量組和APS高劑量組CA1區(qū)AP和PS電壓明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。APS高劑量組較APS低劑量組CA1區(qū)AP、PS電壓降低更明顯（P < 0.05）。見表2。

表2? ?治療后四組海馬CA1區(qū)AP、PS電壓變化比較（mV，x±s）

注：與空白對照組比較，aP < 0.05;與模型對照組比較，bP < 0.05;與APS低劑量組比較，cP < 0.05;APS：黃芪多糖;PS：群峰電位;AP：動作電位

2.3 行為學(xué)及學(xué)習(xí)能力觀察結(jié)果

糖水?dāng)z取實驗結(jié)果顯示，模型對照組大鼠糖水?dāng)z取量較空白對照組明顯減少（P < 0.05）;在定位航行試驗中，與空白對照組比較，模型對照組大鼠逃避潛伏期明顯延長，越臺次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與模型對照組比較，APS低劑量組和APS高劑量組逃避潛伏期縮短，越臺次數(shù)及糖水?dāng)z取量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;與APS低劑量組比較，APS高劑量組各項指標(biāo)變化更明顯（P < 0.05）。見表3。

表3? ?四組大鼠Morris水迷宮及糖水?dāng)z取實驗結(jié)果比較（x±s）

注：與空白對照組比較，aP < 0.05;與模型對照組比較，bP < 0.05;與APS低劑量組比較，cP < 0.05;APS：黃芪多糖

3 討論

黃芪味甘性微溫，其主要化學(xué)成分為APS[14]。具有抑制氧化應(yīng)激損傷及神經(jīng)保護(hù)作用[15-16]。研究表明，NF-κB高激活與PSD病情加重有關(guān)，NF-κB信號通路主要介導(dǎo)組織損傷、應(yīng)激、防御反應(yīng)等重要信息的傳遞，參與缺血性腦卒中血管壁炎性反應(yīng)[17-18]。PPAR-γ可抑制NF-κB的磷酸化反應(yīng)，降低高激活狀態(tài)的NF-κB引起的缺血性腦卒中血管壁炎性反應(yīng)，間接起到對神經(jīng)元的保護(hù)作用[19]。本研究中，APS低劑量組和APS高劑量組NF-κB蛋白及mRNA低表達(dá)，而PPAR-γ蛋白及mRNA明顯高表達(dá)，這提示APS可能通過提高PPAR-γ活性來抑制NF-κB的磷酸化反應(yīng)以降低NF-κB活性。這與王煜等[20]的研究結(jié)果相符。因腦組織持續(xù)性缺血缺氧會導(dǎo)致鈉氫通道開放，而鈉氫通道對維持細(xì)胞內(nèi)pH值以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。過度開放的鈉氫通道會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+超載，進(jìn)而激活Na+-Ca2+通道，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，這是造成PSD患者神經(jīng)細(xì)胞損傷的離子基礎(chǔ)[21]。膜片鉗記錄到模型對照組海馬CA1區(qū)AP、PS電壓較空白對照組明顯升高可能與此有關(guān)，而經(jīng)APS治療后，APS低劑量組和APS高劑量組CA1區(qū)AP、PS電壓均較模型對照組明顯降低，這一結(jié)果也印證了這一推論。提示APS可維持PSD后CA1區(qū)膜電壓穩(wěn)定性，使Na+-Ca2+、Na+-H+交換維持于正常水平，糾正Ca2+超載，保證細(xì)胞內(nèi)pH值和Ca2+水平的平衡有關(guān)，這對防止細(xì)胞酸中毒、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)有重要意義。APS低劑量組和APS高劑量組糖水?dāng)z取量較模型對照組明顯增多，大鼠的逃避潛伏期明顯縮短且穿臺次數(shù)明顯增多，提示經(jīng)APS治療，大鼠抑郁行為減輕，學(xué)習(xí)能力增強。這一治療作用也是上述多因素相互作用的結(jié)果。

綜上所述，APS可減輕PSD大鼠抑郁并提高其學(xué)習(xí)能力，其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號通路的磷酸化反應(yīng)，穩(wěn)定腦海馬CA1區(qū)AP和PS電壓而發(fā)揮對PSD的治療作用。這一研究結(jié)論對開發(fā)新藥用于臨床治療PSD有一定的參考價值。

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（收稿日期：2018-08-14? 本文編輯：張瑜杰）