呂社民，孟列素，朱文華

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種常見的、多發(fā)的、周圍關(guān)節(jié)的慢性免疫性炎癥。在我國的發(fā)病率約為0.3%～0.5%，其病情遷延，主要累及青壯年婦女，是造成我國人群勞動(dòng)力喪失與致殘的主要病因之一。但是，目前對(duì)其病因和發(fā)病機(jī)制的了解還不夠全面，預(yù)防及早期診斷幾無可能，更缺乏特異有效的治療措施[1]。因此，闡明RA的病因和發(fā)病機(jī)制就顯得尤為重要。近年來的研究顯示Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)在RA和實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。

1 TLRs

TLRs是一類重要的模式識(shí)別受體，自從1994年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)人TLR(hTLR)以來，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)鑒定了13種TLRs，其中hTLR包括10種。這些TLR在相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞及免疫效應(yīng)細(xì)胞表面或胞內(nèi)廣泛存在，其中人TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10主要表達(dá)在細(xì)胞膜上并識(shí)別胞外病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，在激活之后會(huì)向吞噬體轉(zhuǎn)移。而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9則表達(dá)在幾乎所有細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)胞器膜上，主要是內(nèi)含體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[2]。

TLRs所識(shí)別的配體主要包括微生物所特有的PAMPs和來源于機(jī)體自身的內(nèi)源性配體，如損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)。當(dāng)配體PAMPs或DAMPs被TLR胞外段識(shí)別并結(jié)合后，使得受體活化(同源、異源寡聚化)，受體的激活將進(jìn)一步招募同樣含有TLR結(jié)構(gòu)域的接頭分子與之結(jié)合，進(jìn)而招募激活相應(yīng)的蛋白激酶，活化對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，實(shí)現(xiàn)對(duì)包括炎性基因在內(nèi)的基因水平調(diào)控(主要涉及NF-κB、MAPK和IRFs家族等信號(hào)通路)[3]。目前，發(fā)現(xiàn)的接頭分子主要包括：MyD88、TRIF(或稱TICAM-1)、TRAM(或稱TICAM-2)、TIRAP(或稱Mal)等，其中在信號(hào)通路中MyD88與TRIF分別發(fā)揮核心作用，其他分子發(fā)揮協(xié)助作用，據(jù)此可將TLRs信號(hào)通路分為MyD88依賴信號(hào)通路與MyD88非依賴信號(hào)通路(即TRIF信號(hào)通路)。TLRs信號(hào)通路活化后介導(dǎo)機(jī)體的天然免疫應(yīng)答，同時(shí)也是聯(lián)系天然免疫與特異性免疫的橋梁，從多個(gè)方面影響著特異性免疫應(yīng)答。

2 TLRs在RA中的作用機(jī)制研究

TLRs的功能提示其在自身免疫性疾病RA中可能具有重要意義。研究者們?cè)诨颊叩拿庖咂鞴俸突そM織中，通過TLRs表達(dá)譜篩查或者特定TLR的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)某些TLRs表達(dá)異常，而表達(dá)異常則是功能異常的基礎(chǔ)，提示這些TLRs或在RA的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。進(jìn)而在動(dòng)物模型中通過基因敲除或在體RNA干擾等技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵TLR的作用，而它們發(fā)揮作用的確切分子機(jī)制則需進(jìn)一步在參與疾病的各型細(xì)胞中進(jìn)行充分闡明。

2.1表達(dá)異常的TLR可能在RA中扮演重要角色研究顯示RA患者的滑膜組織、滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast like synoviocyte, FLS)、外周血單核細(xì)胞(PBMCs)及滑液中的CD14+巨噬細(xì)胞中TLR2、TLR3、TLR4、TLR7表達(dá)升高[4-6]。其中TLR2在RA的研究中倍受關(guān)注，不僅在患者的滑膜組織中高表達(dá)，在參與RA的各種細(xì)胞上也均有表達(dá)，如RA患者的外周血CD16+單核細(xì)胞、CD64+單核細(xì)胞和滑膜組織中的巨噬細(xì)胞都高表達(dá)TLR2[7-8]。TLR3也是研究者所關(guān)注的重要模式識(shí)別受體，與正常組織或骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者相比，RA患者滑膜組織TLR3表達(dá)增高，主要在滑膜襯層FLS中表達(dá)豐富[6,9-11]。TLR4在早期和持續(xù)期RA患者的滑膜中均呈現(xiàn)高表達(dá)，在FLS中表達(dá)也非常豐富[11-12]。2005年ROELOFS[6,13]發(fā)現(xiàn)在RA患者的滑膜組織TLR7高表達(dá)，其可能與TLR3、TLR8、TLR9在RA中共同發(fā)揮作用。但是，OSPELT[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FLS并不表達(dá)TLR7-10，因此闡明TLR7/8與RA關(guān)系仍需更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

這種采用RA患者的組織樣本研究TLR的表達(dá)是揭示其作用的重要手段之一，但是實(shí)時(shí)監(jiān)控患者組織中TLR的表達(dá)變化卻難以實(shí)施，加之患者的異質(zhì)性也常常會(huì)掩蓋實(shí)驗(yàn)的真實(shí)結(jié)果。因此，動(dòng)物模型在RA的研究中成為了必不可少的手段。當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型主要包括：Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(collagen II-induced arthritis, CIA)和佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型等，它們都從某些側(cè)面反映了RA的特征，是研究RA發(fā)病機(jī)制的良好工具[14]。在CIA小鼠的滑膜中TLR2的表達(dá)升高[7]。另外，本研究組在以關(guān)節(jié)炎易感的近交系DA大鼠構(gòu)建的降植烷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(pristane-induced arthritis, PIA)模型中，脾臟和滑膜組織中的TLR表達(dá)譜檢測(cè)顯示TLR1～TLR9均有表達(dá)，其中TLR3 mRNA在早期(發(fā)病前)表達(dá)，并在疾病的急性期中保持高水平[15-17]。進(jìn)一步的研究顯示TLR3在PIA大鼠脾臟巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，而且使用降植烷刺激巨噬細(xì)胞時(shí)，TLR3的表達(dá)呈時(shí)間和濃度依賴性上調(diào)，其下游細(xì)胞因子IFN-β和TNF-α表達(dá)升高，提示降植烷可能通過影響巨噬細(xì)胞TLR3從而介導(dǎo)PIA的發(fā)生發(fā)展[15]。

同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)在RA患者的血清、滑液和滑膜中某些TLR的配體含量增加，如在血清和滑液中TLR4配體增加[6]，在患者滑膜組織中也檢測(cè)到豐富的TLR4配體-HSPB8[18]，在一些RA患者的關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌DNA(TLR9配體)[19]。這些研究結(jié)果顯示在RA和實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中存在異常表達(dá)的TLR和某些TLR配體含量的變化，推測(cè)這些TLR可能對(duì)疾病啟動(dòng)和進(jìn)展具有重要作用。

2.2在體研究證實(shí)關(guān)鍵TLR在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的重要性如前所述，在RA和實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎中確實(shí)存在某些表達(dá)改變的TLR和含量增加的TLR配體，那么這些TLR是否在炎癥的發(fā)生和進(jìn)展中起到重要作用呢？研究者們構(gòu)建了多種TLR干預(yù)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型進(jìn)行了TLR的作用及機(jī)制分析，包括使用TLR敲除小鼠或采用TLR配體的在體干預(yù)。本研究組通過對(duì)PIA大鼠尾根部皮下分別注射肽聚糖(PGN、TLR2配體)、poly I∶C(TLR3配體)、LPS(TLR4配體)等配體，在體干預(yù)關(guān)節(jié)炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)PGN和poly I∶C都對(duì)疾病有明顯的加重作用，提示TLR2和TLR3介導(dǎo)的信號(hào)通路在PIA發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用[15,20]。已有研究報(bào)道某些TLR配體可直接誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎，如肽聚糖或鏈球菌細(xì)胞壁可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥，該作用主要依賴于TLR2信號(hào)途徑。但也有研究顯示TLR2-/-小鼠與野生型小鼠相比，可罹患更嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎[21]。關(guān)節(jié)腔注射poly I∶C后，可引起嚴(yán)重的一過性關(guān)節(jié)炎[22]。我們?cè)赑IA高表達(dá)TLR3之后，對(duì)PIA大鼠關(guān)節(jié)腔注射poly I∶C，結(jié)果顯示PIA發(fā)病時(shí)間明顯提前，病情加重[16]。進(jìn)一步通過RNAi技術(shù)在體實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示降低TLR3表達(dá)，大鼠PIA癥狀及滑膜炎等病理表現(xiàn)顯著減輕[15]。然而有研究發(fā)現(xiàn)poly I∶C對(duì)膠原抗體誘導(dǎo)和血清誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎有抑制作用，這種抑制作用依賴于Ⅰ型IFN[23]，顯示TLR3在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制仍有矛盾之處。TLR4基因敲除小鼠患抗CII抗體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的癥狀顯著輕于野生型小鼠，亦可減輕IL1ra基因缺失引起的嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎，而且敲除小鼠罹患CIA的發(fā)病率下降，病情亦減輕[21,24]。但也有研究者發(fā)現(xiàn)使用包含有沙眼衣原體滑膜細(xì)胞進(jìn)行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎時(shí)，TLR4基因缺陷小鼠卻顯示出更嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎癥狀[25]。利用TLR7-/-小鼠誘導(dǎo)的CIA癥狀顯著減輕[26]。含有未甲基化CpG的細(xì)菌DNA(TLR9配體)可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，而采用抑制性寡脫氧核糖核酸(ODBs)可以防止CpG DNA介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎發(fā)展[27]。

這些研究結(jié)果顯示抑制相關(guān)TLR的功能和表達(dá)對(duì)關(guān)節(jié)炎具有一定的治療效果。說明TLR2、TLR3、TLR4等的確參與了實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎和RA的進(jìn)展，但是卻存在著一些相互矛盾的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，這就需要進(jìn)一步在參與RA的關(guān)鍵細(xì)胞中探討不同TLR發(fā)揮作用的分子機(jī)制，揭示其作用通路。

2.3體外研究探討關(guān)鍵TLR參與RA和實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制關(guān)鍵TLR在RA關(guān)鍵細(xì)胞中的分子作用機(jī)制也是研究者們關(guān)注的重要問題。FLS是滑膜炎癥發(fā)生發(fā)展中的重要靶細(xì)胞，巨噬細(xì)胞、DC、T細(xì)胞、B細(xì)胞等也可能通過TLR在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用。除此之外，軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等也在RA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

2.3.1TLR可介導(dǎo)FLS炎癥因子、趨化因子的產(chǎn)生 研究者們發(fā)現(xiàn)TLR2及TLR4配體刺激FLS后，細(xì)胞分泌VEGF、CXCL8、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子及趨化因子增加，此外粘附分子ICAM-1和各種金屬蛋白酶的表達(dá)水平也升高[28-29]。PGN也可促使RA-FLS產(chǎn)生更多IL-15，LPS能夠加強(qiáng)其誘導(dǎo)作用，這可能促進(jìn)了滑膜炎的發(fā)展[30]。PGN 還可促進(jìn)FLS的14個(gè)CC和CXC 趨化因子表達(dá)上調(diào)，包括GCP-2(granulocyte chemotactic protein-2)、RANTES、MCP-2(monocyte chemoattractant protein-2)、IL-8等，它們可能參與了RA關(guān)節(jié)的炎性滲出[31]。LTA也可刺激RA-FLS產(chǎn)生IL-6，PKCS、c-Src、AP-1和NF-κB信號(hào)通路都參與了該過程[32]。腸道血管活性肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)可下調(diào)LPS和TNF-α誘導(dǎo)的RA-FLS中的TLR4和MyD88表達(dá)，也會(huì)降低LPS刺激下的CCL2和CXCL8生成，可見VIP對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療機(jī)制與抑制TLR4表達(dá)和信號(hào)通路有關(guān)[12]。

壞死滑液細(xì)胞釋放的RNA也可能作為TLR3的內(nèi)源性配體刺激滑膜成纖維細(xì)胞促炎癥反應(yīng)基因的表達(dá)[9]。使用TLR3的配體poly I∶C刺激FLS，可以增加IFN-β、CXCL10、CCL5、IL-6、MMP-3和MMP-13的分泌[9,11]。該配體還可通過NF-κB通路影響FLS分泌TSLP(thymic stromal lymphopoietin)，VEGF、IL-8從而參與RA的進(jìn)展[10,33]。盡管FLS中表達(dá)TLR9，但KYBURZ[34]發(fā)現(xiàn)CpG DNA卻不能像細(xì)菌PGN一樣激活FLS。

2.3.2TLR介導(dǎo)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能發(fā)生改變 免疫細(xì)胞在包括RA在內(nèi)的自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。TLR2配體及TLR4配體可刺激RA患者的DC細(xì)胞產(chǎn)生豐富的炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-6、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)，這些炎癥因子可能對(duì)關(guān)節(jié)炎癥通路有一個(gè)放大作用。但是，TLR3或者TLR7的配體卻可以抑制該效應(yīng)[6,35]。使用TLR3配體刺激RA患者的DC、單核細(xì)胞及FLS均可導(dǎo)致I型IFN的分泌增加，反過來IFN-α也可以增加TLR3的表達(dá)[13]。同時(shí)，TLR3的配體刺激可顯著降低來源于RA患者和正常對(duì)照的DC細(xì)胞分泌MIF[35]。TLR3配體的刺激會(huì)使RA患者的DC分泌的細(xì)胞因子平衡趨于IL-12生成，也可以刺激PMBC和FLS產(chǎn)生大量的IP-10/CXCL10，IP-10/CXCL10不僅可以激活表達(dá)CXCR3的Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞，也可以對(duì)抗CCR3依賴的Th2細(xì)胞的趨化[6,36]。

支原體的致關(guān)節(jié)炎作用可能與通過TLR2激活巨噬細(xì)胞有關(guān)[37]。來自RA患者關(guān)節(jié)的CD14+巨噬細(xì)胞不僅高表達(dá)TLR2，也高表達(dá)TLR4，在PGN和LPS刺激下，其分泌TNF-α和IL-8的能力顯著增強(qiáng)[4]。ZARE等[38]發(fā)現(xiàn)TLR3的配體dsRNA可通過巨噬細(xì)胞及其產(chǎn)物參與小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，IL-1R在其中起著重要作用。也有研究發(fā)現(xiàn)dsRNA的致關(guān)節(jié)炎能力與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌Ⅰ型IFN的能力有關(guān)，并且依賴于Ⅰ型IFN受體信號(hào)通路[39]。我們的研究結(jié)果顯示降植烷和poly I∶C均可上調(diào)并激活TLR3通路，促使巨噬細(xì)胞的TNF-α、IFN-β等炎癥因子分泌[15]。

此外，人工合成的TLR2配體細(xì)菌脂蛋白(bacterial lipoprotein, BLP)在缺如APC時(shí)，可與抗CD3抗體一起誘導(dǎo)Tregs和效應(yīng)T細(xì)胞的增殖，不過這種Tregs沒有抑制功能，這可能也是TLR2參與自身免疫疾病的機(jī)制之一[40]。同時(shí)，TLR2能夠影響小鼠關(guān)節(jié)炎模型中的T細(xì)胞平衡，TLR2缺失促使Th2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)向病理性的Th1細(xì)胞，從而調(diào)控關(guān)節(jié)炎癥發(fā)展[21]。PIA大鼠脾臟T細(xì)胞與FLS共孵育后，F(xiàn)LS的侵襲能力增強(qiáng)，其TLR3、IFN-β、IL-6和MMP3的表達(dá)也上調(diào)，但如果采用TLR3抗體封閉FLS后，就阻斷了細(xì)胞因子和MMP3的上調(diào)。這提示脾臟活化的T細(xì)胞參與介導(dǎo)了關(guān)節(jié)局部炎癥，包括FLS的活化增殖和炎癥因子分泌等，而脾臟T細(xì)胞(或稱為“關(guān)節(jié)特異性T細(xì)胞”)的激活則可能與PIA大鼠脾臟中TLR3high巨噬細(xì)胞相關(guān)。

自身反應(yīng)性B細(xì)胞在RA中的作用毋庸置疑，而有研究顯示TLR7/8與TLR9可以阻止發(fā)展中的自身反應(yīng)性B細(xì)胞募集，在RA的發(fā)生中可能有一定作用[41]。但也有報(bào)道指出高度甲基化的CpG可以激活自身反應(yīng)性B細(xì)胞，從而產(chǎn)生RFs、IL-6和TNF-α，還可誘導(dǎo)其向漿細(xì)胞分化，參與RA的發(fā)病[42-44]。這些研究顯示參與RA和實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的免疫細(xì)胞在不同程度上通過TLR通路介導(dǎo)了其效應(yīng)。

2.3.3TLR對(duì)其他參與RA的細(xì)胞功能的調(diào)控 CXCL9是參與自身免疫性關(guān)節(jié)炎的重要趨化因子，TLR2配體PGN或TLR4配體LPS聯(lián)合IFN-γ可以誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞CXCL9和CXCL10的產(chǎn)生，參與自身免疫性關(guān)節(jié)炎[45]。TLR2還可介導(dǎo)軟骨細(xì)胞中VEGF的生成，通過這些因子促進(jìn)血管生成和軟骨破壞，促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)展[46]。除了可通過巨噬細(xì)胞和DC發(fā)揮作用，TLR3配體dsRNA亦可聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞中各種趨化因子如CXCL9、CXCL10及CXCL11的產(chǎn)生升高。

這些研究顯示，TLR2、TLR3、TLR4、TLR7/8、TLR9在RA和實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的組織和細(xì)胞中均有一定程度表達(dá)，可通過自身的表達(dá)調(diào)控和信號(hào)活化，介導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子、MMP等介導(dǎo)局部炎癥的啟動(dòng)和維持。但是，它們?cè)趨⑴cRA和實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎時(shí)有著復(fù)雜交錯(cuò)的關(guān)系，可以相互協(xié)同，也可以相互拮抗，也可能互相調(diào)控，在不同的組織和細(xì)胞中也可能有不同的表現(xiàn)，而要想清晰獲得TLRs在RA發(fā)病機(jī)制中的作用網(wǎng)絡(luò)，則需要更全面和深入的研究。盡管如此，某些確定的TLR作用通路已被認(rèn)為是治療RA的潛在靶點(diǎn)，為關(guān)節(jié)炎的新藥研發(fā)提供了新的思路。

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