孫美英，何劍斌

（沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110866）

金黃色葡萄菌球菌毒力基因在傳代過程中的穩(wěn)定性

孫美英，何劍斌?

（沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110866）

為了解分離自奶牛乳房炎的金黃黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）毒力基因在傳代過程中的穩(wěn)定性，對傳代前后金黃色葡萄球菌的毒力和毒力基因進行測定和檢測。本研究采用急性毒性試驗的方法測定8株金黃色葡萄球菌原代、第5代、第10代、第15代、第20代及第25代的菌株對小鼠的半數(shù)致死量，通過聚合酶鏈式反應（PCR）檢測原代、第5代、第10代、15代、第20代及第25代的菌株中5種毒力基因ZFB、ALF、BET、X jngm及Nuc的變化情況。試驗結果表明，金黃色葡萄球菌在傳代過程中毒力基因分布較穩(wěn)定；但X jngm、ALF、BET基因極易發(fā)生變異。經小鼠腹腔連續(xù)多次傳代后毒力逐漸增大，可推知X jngm毒力基因與毒力相關性最大，并易受傳代影響。

金黃色葡萄球；毒力基因；傳代；穩(wěn)定性

金黃色葡萄球菌是廣泛的感染人和不同種動物的一種常見致病菌，主要分離自奶牛乳腺炎[1]。金黃色葡萄球菌致病力與其能大量產生細胞外毒素和毒力基因密切相關。金黃色葡萄球菌所分泌的α溶血素、β溶血素、粘附素B[2]、耐熱核酸酶、血漿凝固酶等是重要的毒力因子。ALF、BET、ZFB、Nuc及Xjngm是編碼此類毒力因子的重要毒力基因，與金黃色葡萄球菌有無毒力或毒力強弱有較高相關性。一般情況下，病原菌在體外人工培養(yǎng)基上連續(xù)多次傳代后，毒力一般都逐漸減弱甚至消失，而在大量的動物試驗中，都是通過將細菌接種于動物腹腔的方法提高細菌毒力。本研究通過對傳代前后金黃色葡萄球菌毒力基因的檢測分析，探討傳代對毒力基因分布的影響，而上述這些方面的研究力圖揭示病原菌在連續(xù)傳代時的毒力變化是否與病原菌毒力基因型選擇相關，可為充分掌握病原菌在傳代時毒力發(fā)生變化的原因提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC2393購自杭州天和微生物試劑有限公司，試驗金黃色葡萄球菌株皆分離自近期遼寧沈陽周邊奶牛場患乳房炎的病牛。各金黃色葡萄球菌株用50%甘油-70℃保存。

1.1.2 試驗動物 15～20 g的SPF級雌性和雄性昆明小鼠。小鼠體況相近時用于試驗，試驗期間小鼠于室溫穩(wěn)定的清潔級鼠房飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細菌毒力測定 試驗時，各菌株均分別接種普通血瓊脂平板（37℃培養(yǎng)24 h）復蘇，然后接種3 mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃ 300 r/min培養(yǎng)10 h后，2 000 r/min離心10 min，用滅菌生理鹽水配制成OD為1的菌液。取10只小鼠腹腔注射金葡菌液1 mL，記錄第1代小鼠存活時間；將第1代腹腔注射死亡最早的小鼠用酒精消毒后解剖，用無菌棉簽取樣，接種于血平板中37℃培養(yǎng)24 h，用滅菌的生理鹽水配制OD為1的金葡菌，取10只小鼠腹腔注射菌液1 mL，記錄第2代小鼠存活的時間。重復試驗并記錄直到第25代小鼠的存活時間。

1.2.2 細菌鑒定 對每代死亡小鼠腹部進行消毒，剖開腹腔用無菌棉簽取樣，革蘭氏染色涂片鑒定，細菌血平板培養(yǎng)，對培養(yǎng)出來的菌落進行生化鑒定[4]和PCR鑒定[5]。

1.2.3 DNA的提取及純化 取新培養(yǎng)好的菌體（10株金葡菌的原代、第5代、第10代、第15代、第20代及第25代菌體）按SDS法提細菌基因組DNA。方法如下。

細菌接種于5 mL液體LB中，37℃搖床（300 r/min）培養(yǎng)過夜。取1 mL培養(yǎng)物于1.5 mL EP管中，室溫8 000 r/min離心5 min，棄上清沉淀重懸于1 mL TE（pH 8.0）。菌體裂解：加入6μL 50 mg/mL溶菌酶37℃ 2 h，再加2 mol/L NaCl 50μL、10%SDS 110μL和20 mg/mL蛋白酶K 3μL，37℃過夜。抽提：取1 mL菌液加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）混勻，室溫放置10 min 12 000 r/min離心10 min。取800μL上清（注意不要吸到中間蛋白層）加入等體積酚:氯仿:異戊醇（25: 24:1）混勻，室溫放置10 min，12 000 r/min離心10 min。取500μL上清加0.6倍體積異丙醇（冷）混勻放-20℃ 20 min，12 000 r/min離心10 min棄上清洗滌，沉淀用75%乙醇洗滌7 500 r/min離心10 min棄乙醇抽晾干后溶于50μL TE中。

1.2.4 毒力基因檢測

1.2.4.1 引物設計 根據Genbank中公開發(fā)表的金黃色葡萄球菌主要毒力因子溶血毒素、血漿凝固酶和黏附素耐熱核酸酶序列設計檢測特異引物，并由上海生工合成引物。引物序列見表1，用去離子水按20μmol/L的濃度溶解，-20℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.4.2 PCR反應擴增及序列測定 PCR擴增體系：25μL PCR反應體系：10×PCR buf fer 2.5μL，Mg2+（25 mM）1.5μL，dNTP（40 mM）0.5μL，Taq酶（2.5 U）0.5μL，引物各1μL，模板2μL，無菌雙蒸水14μL。

表1 5種毒力基因PCR擴增引物序列Table1 PCR am plification primer sequences of Five virulence gene

PCR產物電泳檢測：取5μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠濃度為2%，電泳電壓90 V，電泳時間25 min，經凝膠成像后統(tǒng)計結果[7]。

1.2.5 傳代過程中存的測定 取新鮮培養(yǎng)好的菌液（10株金葡菌的原代、第5代、第10代、第15代、第20代及第25代菌體），分別注射入小鼠腹腔通過死亡時間判斷毒力大小變化。

表2 5種毒力基因反應程序Table2 Response procedures of five virulence genes

2 結果

2.1 傳代過程中5種毒力基因分布的變異結果

2.1.1 8株金葡菌在傳代過程中5種對基因的PCR擴增結果 見圖1。

圖1 8株金葡菌在傳代過程中5種毒力基因的PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR amp lification electrophoresis figure of 5 virulence genes 8 strains s.aureus bacteria in the process of batches

2.1.2 8株金葡菌在傳代過程中5種對基因的遺傳穩(wěn)定性 從圖1可以計算出5種毒力基因在傳代過程中的攜帶率，可以看出5種毒力基因在原代、第5代、第10代、第15代、第20代及第25代分布結果顯示其遺傳穩(wěn)定性較高，Xjngm、ALF、BET基因攜帶率發(fā)生較大變化，尤其Xjngm在第20代和第25代該毒力基因均未檢出。Nuc在原代、第5代、第10代、第15代、第20代攜帶率基本沒變化，在第25代攜帶率變化較大。ZFB的攜帶率基本沒變化，見圖2。

2.2 傳代過程中小鼠平均存活時間的變化結果 見圖3和表3。

從圖3可以看出，經過多次傳代后，隨著代數(shù)的增加，菌株的毒力逐漸增強。根據表3可知，LSD0.05=4.872，LSD0.01=6.537可知，原代與第5代、第10代、第15代、第20代及第25代差異極顯著。

表2 5種毒力基因反應程序Table2 Response procedures of five virulence genes

圖2 8株金黃色葡萄球菌在傳代過程中5種毒力基因的攜帶率Fig.2 Carrying rate of 5 kinds virulence gene from 8 strains staphylococcus aureus in batches

圖3 各代小鼠存活代數(shù)Fig.3 Survival time of each generation m ice

3 討論

大量試驗表明，金黃色葡萄球菌在經小鼠腹腔傳代過程中，基因組發(fā)生較高頻率突變，導致菌株發(fā)生變異，隨著代數(shù)的增多，變異機會增大，毒力大小也發(fā)生明顯變化，可見傳代是使其毒力發(fā)生變化的一個不可忽視的因素。Xjngm、ALF、BET基因攜帶率發(fā)生較大變化，尤其Xjngm在第20代和第25代該毒力基因均未檢出。Nuc在原代、第5代、第10代、第15代、第20代攜帶率基本沒變化，在第25代攜帶率變化較大。ZFB的攜帶率基本沒變化。經測序與原代序列同源性達99%。

本試驗所檢測的5種毒力基因均是致病菌侵染途徑中較重要的因子，經毒力與毒力基因型的比較分析，可推知，Xjngm、ALF、BET基因與毒力相關性較大，但是Xjngm、ALF、BET基因在傳代培養(yǎng)過程中，極易發(fā)生變異。Xjngm、ALF、BET基因共同缺失導致毒力變化，還是其中一種單獨缺失導致金黃色葡萄球菌毒力變化。ZFB是否與其他4種毒力基因相互協(xié)同作用導致毒力增強，由于是初步探索性試驗還不能下結論，需要進一步試驗證明。

致病菌所特有的毒力基因常位于轉座子、質粒和噬菌體等可移動的遺傳物質上。近年來，細菌毒力島的發(fā)現(xiàn)使人們對細菌毒力的變異方面也有了新的認識，細菌的毒力基因在傳代過程中發(fā)生的變異，應該與質粒、噬菌體及細菌毒力島等遺傳物質的變化相關[8-9]。

毒力因子往往是疫苗的主要組成成分，因此對毒力因子進行深入研究的目的除了了解其致病機理外，對疫苗的研究也有重要意義。維持毒種在規(guī)定傳代次數(shù)內的遺傳穩(wěn)定性，是所生產的疫苗安全性、有效性和高產性的重要保證。

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[4]孔雪旺，陳功義.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國奶牛，2007，1（1）：43-44.

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（編輯：張婷婷）

Stability of Virulence Genes in Staphylococcus aureus Strains During Subculture

Sun MeiYing,He JianBin*
（Shenyang Agricul tur University,animal husbandry and veterinary col lege,Liaoning Shenyang 110866）

To study the stabil ity of virulence genes of S.aureus st rains which was isolated f rom mastitis during subcul ture,toxicity and toxicity gene were detected before and af ter subcultured.8 st rains original,the 5th generation,the 10th generation,the 15th generation,the 20th generation and the 25th generation S.aureus were administered to mice in order to detecte the median lethal rate.Variation of Vir genes including ZFB,ALF,BET,Xjngm and Nuc were investigated by PCR.The resul ts showed that the vir gene dist ribution kept stable during passage.But Xjngm、ALF、BET genes mutated ext remely.Toxicity increased af ter passed many times f rom mice,which indicated that Xjngm has the most dependabi l ity to toxicity,and is easily be af fected by subcul ture.

S.Aureus;Virulence genes;Subcul ture;Stabil ity

S852.6

：B

：1672-9692(2014)02-0013-04

2013-12-02

孫美英（1988-），女，碩士研究生在讀，研究方向為臨床獸醫(yī)。

何劍斌（1969-），男，教授，沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院院長，主要研究方向為臨床獸醫(yī)學。