高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法檢測芪白平肺膠囊中3種人參皂苷含量

王 斌，孟 楣，劉先華，周 安，王傳博，童佳兵，李澤庚

（1.安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心，安徽合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230031；3.安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，安徽合肥 230601；4.國家中醫(yī)藥管理局慢性阻塞性肺疾病肺氣虛證重點研究室，安徽合肥 230038）

高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法檢測芪白平肺膠囊中3種人參皂苷含量

王 斌1，孟 楣2，劉先華1，周 安1，王傳博3，童佳兵2，李澤庚4

（1.安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心，安徽合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230031；3.安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，安徽合肥 230601；4.國家中醫(yī)藥管理局慢性阻塞性肺疾病肺氣虛證重點研究室，安徽合肥 230038）

目的 采用高效液相色譜儀－蒸發(fā)光散射檢測器（high performance liquid chromatography－evaporative light scattering detector，HPLC－ELSD）建立芪白平肺膠囊中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量測定方法。方法 采用色譜柱為Hypersil ODS XB－C8柱（4.6mm×250mm，5μm）和Hypersil ODS XB－C18柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈為流動相A、以水為流動相B進行梯度洗脫；洗脫程序（0～40min，A 19％；40～55min，A 19％～40％），流速為1.2ml／min，柱溫為30℃。ELSD參數(shù)優(yōu)化：漂移管溫度分別設為50、70、90、110℃，載氣流量分別為1.0、1.2、1.4、1.6L／min。結果 通過對比研究，最終采用Hypersil ODS XB－C8柱作為分析柱，漂移管溫度為90℃，載氣流量為1.2L／min時，3種人參皂苷的含量檢測結果最佳。人參皂苷Rg1、Re和Rb1的加樣回收率分別為98.3％、99.1％、101.8％，RSD分別為0.67％、1.03％、1.22％。結論 所選擇的色譜柱和優(yōu)化的ELSD參數(shù)可準確測定芪白平肺膠囊中3種人參皂苷的含量，且重現(xiàn)性好。

芪白平肺膠囊；高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法；人參皂苷；含量測定

芪白平肺膠囊是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑，含有黃芪、人參、川芎、地龍、五味子、葶藶子、薤白7味中藥［1］，其中黃芪和人參為君藥。臨床和藥效學實驗［2－5］表明，芪白平肺膠囊可用于治療慢性阻塞性肺疾病。本研究采用高效液相色譜儀－蒸發(fā)光散射檢測器（high performance liquid chromatography－evaporative light scattering detector，HPLC－ELSD）對芪白平肺膠囊中3種人參皂苷的含量進行測定，以探討該制劑的質量控制方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型HPLC（包括二元泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱、380－LC型ELSD檢測器）：美國安捷倫公司；BP211D型十萬分之一電子天平：德國賽多利斯公司；HS10260D型超聲清洗器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；人參皂苷Re（批號110754－201123）、人參皂苷Rg1（批號110703－201128）和人參皂苷Rb1（批號110754－201122）對照品：由中國食品藥品檢定研究院提供。芪白平肺膠囊（批號20120104、20120813、20130320）：由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑中心提供；黃芪、人參、川芎、地龍、五味子、葶藶子、薤白：購于安徽省合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司，由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院李立華主任藥師鑒定；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備：精密稱定人參皂苷Rg1對照品1.8mg；人參皂苷Re對照品1.0mg；人參皂苷Rb1對照品2.5mg；加甲醇溶解，配置成混合對照品貯備液（人參皂苷Rg1、Re和Rb1對照品質量濃度分別為72、40、100mg／L）。

2.1.2 供試品溶液的制備：取膠囊內容物2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇80ml超聲處理30min，濾過，蒸干，水轉移殘渣至分液漏斗中，乙醚脫脂后，用水飽和的正丁醇萃取4次（依次為40、30、30、20ml），合并正丁醇液，20ml氨試液洗滌2次，正丁醇液蒸干，甲醇溶解并轉移至10ml容量瓶中，定容，冷藏備用。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備：按組方取10粒量的缺人參藥材，依照處方制備工藝制得缺人參膠囊內容物4.0g，取2.0g按“2.1.2項”下的供試品溶液制備方法，得陰性樣品溶液10ml。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Hypersil ODS XB－C8（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈為流動相A、以水為流動相B進行梯度洗脫（0～40 min，A 19％；40～55min，A 19％～40％），流速為1.2 ml／min，柱溫為30℃。ELSD參數(shù)：漂移管溫度為90℃，載氣流量為1.2L／min，進樣量為20μl。在選定條件下，人參皂苷Rg1、Re和Rb1與樣品中其他組分色譜峰可基線分離，且陰性樣品在人參皂苷Rg1、Re和Rb1出峰處無干擾，理論塔板數(shù)以人參皂苷Rg1、Re和Rb1計均大于10 000。見圖1。

圖1 樣品、混合對照和陰性樣品的高效液相色譜圖

2.3 線性關系考察 分別吸取混合對照品溶液5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0μl注入液相色譜儀，分別以3個對照品的6個進樣量的常用對數(shù)（lgx）為橫坐標，以峰面積的常用對數(shù)（lgy）為縱坐標，進行線性回歸，人參皂苷Rg1、Re和Rb1的線性回歸方程分別為：lgy1＝1.657 6lgx1＋1.402 3， r1＝0.999 1；lgy2＝1.372 8lgx2＋1.518 7，r2＝0.999 3；lgy3＝1.936 9lgx3＋1.251 3，r3＝0.999 2。結果表明，人參皂苷Rg1、Re和Rb1進樣量分別在0.36～7.20μg、0.20～4.00μg和0.50～10.00μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗 分別吸取混合對照品溶液20μl，參照“2.2”項下的色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積。結果表明，人參皂苷Rg1、Re和Rb1峰面積的RSD（n＝6）分別為0.86％、0.78％和0.42％，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（批號20120104）在0、2、4、8、12、24h分別進樣20μl，記錄峰面積。結果表明，人參皂苷Rg1、Re和Rb1峰面積的RSD分別為0.98％、1.03％、1.65％。表明供試品溶液在24h內基本穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗 取同一批號的樣品（批號20120104），按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，測得峰面積并計算含量。結果表明，人參皂苷Rg1、Re和Rb1含量的RSD分別為1.31％、1.45％和1.13％。提示該方法重復性較好。

2.7 回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（批號20120104）2.0g，共6份，按“2.1.2”項下方法處理，加入等質量濃度的人參皂苷Rg1、Re和Rb1對照品，測定，計算回收率。見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

2.8 樣品含量測定 取3批膠囊內容物（批號分別為20120104、20120813、20130320），每批3份，按“2.1.2”項下方法制備3批供試品溶液，共9份。參照“2.2”項下的色譜條件各進樣20μl，記錄峰面積，代入標準曲線，按照標準曲線法計算樣品中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。測得人參皂苷Rg1、Re、Rb1的平均含量分別為0.332 5、0.376 5、1.162 5 mg／g。

3 討論

3.1 檢測器的選擇 原來參照文獻［6］用高效液相色譜－紫外檢測法測定人參皂苷Rg1、Re和Rb1含量，但受噪音和梯度洗脫的影響，造成基線漂移。并且芪白平肺膠囊為復方，所含成分較多，若使用較低的紫外檢測波長（203nm）檢測，則導致紫外末端吸收，雜質對色譜峰的干擾也較大。而ELSD作為一種通用質量型檢測器，其響應不依賴樣品的光學性質，只要樣品的揮發(fā)性低于流動相即可被檢測，不存在紫外末端吸收的問題，且對流動相的變化不敏感，即使在梯度洗脫時基線也很平穩(wěn)［7］。通過調節(jié)ELSD的漂移管溫度與載氣流速，可以使基線噪音最小，響應值相對最高，從而獲得很好的色譜圖。所以本實驗最終采用HPLC－ELSD法測定人參中皂苷類成分。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的優(yōu)化：在色譜柱的選擇上，本研究對比了Hypersil ODS XB－C8柱（4.6mm×250 mm，5μm）和Hypersil ODS C18柱（4.6mm×250 mm，5μm）在同等條件下對樣品中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的分離效果，結果顯示前者可實現(xiàn)3種皂苷的有效分離，效果更佳，故最終選擇C8柱對樣品進行檢測。

3.2.2 流動性比例的選擇：由于樣品色譜圖中峰較多，且實現(xiàn)人參皂苷Rg1、Re的有效分離要求較高，故對流動相配比進行了考察。經(jīng)多次摸索發(fā)現(xiàn)，流動相在40min前采用等度洗脫（0～40min，乙腈19％）可得到人參皂苷Rg1、Re的單峰，并實現(xiàn)了二者的分離。40min后采用梯度洗脫（40～55min，乙腈19～40％）可獲得理想分離度的人參皂苷Rb1的單峰。所以最終采用此洗脫方法。

3.3 ELSD條件的優(yōu)化 選用ELSD檢測器時，蒸發(fā)溫度和載氣流速對測定結果影響很大。蒸發(fā)溫度低時，溶劑揮發(fā)不完全；溫度高時，由于分析樣品部分揮發(fā)，導致顆粒量下降而使檢測器響應下降［8］。本實驗將漂移管溫度分別設定為50、70、90、110℃，結果顯示漂移管溫度為90℃時檢測器響應最好，故最終選擇90℃作為蒸發(fā)溫度。載氣流速是另一個影響測定結果的重要參數(shù)，當載氣的流速太低時，會形成大量的微粒從而導致尖峰信號或噪聲信號；當載氣流速太高時，微粒量會下降，從而導致信號響應降低［8］。本實驗將載氣流速分別設定為1.0、1.20、1.40、1.60L／min，結果顯示載氣流速為1.20L／min時檢測器響應最好，故最終選擇1.20L／min的載氣流速。

［1］葛平，陳娟，李澤庚，等.芪白平肺膠囊定性定量方法研究［J］.安徽醫(yī)藥，2012，16（10）：1415－1418.

［2］李澤庚，王傳博，彭波，等.芪白平肺膠囊對慢性阻塞性肺疾病患者BODE指數(shù)的影響［J］.中醫(yī)雜志，2010，51（11）：987－989.

［3］王傳博，李澤庚，彭波，等.芪白平肺膠囊對慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺證模型大鼠NO、ET－1及FIB的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（1）：91－93.

［4］李澤庚，王傳博，彭波，等.芪白平肺膠囊對慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺證模型大鼠血氣分析的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（3）：569－570.

［5］李澤庚，王傳博，彭波，等.芪白平肺膠囊對慢阻肺痰瘀阻肺證模型大鼠肺功能的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2009，23（6）：51－53.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：8.

［7］趙宇新，李曼玲.蒸發(fā)光散射檢測器在中藥成分分析中的應用［J］.中國中藥雜志，2003，28（10）：913－917.

［8］石威，王玉堂，權新軍，等.高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法測定人參根中人參皂苷的含量［J］.分析化學，2006，34（2）：243－246.

Determination of Three Ginsenosides in Qibai Pingfei Capsules by High－Performance Liquid Chromatography－Evaporative Light－Scattering Detector

WANG Bin1，MENG Mei2，LIU Xian－h(huán)ua1，ZHOU An1，WANG Chuan－bo3，TONG Jiabing2，LI Ze－geng4
（1.Experimental Research Center，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China；2.The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China；3.The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Anhui Hefei 230601，China；4.Key Laboratory of Chronic Obstructive Pulmonary Disease with Lung－Qi Deficiency Syndrome，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China）

Objective To establish a method for determining the content of ginsenosides Rg1，Re，and Rb1in Qibai Pingfei Capsules by high－performance liquid chromatography－evaporative light－scattering detector（HPLC－ELSD）.Methods HPLC was performed on a Hypersil ODS XB－C8column（4.6mm×250mm，5μm）or Hypersil ODS XB－C18column（4.6mm×250mm，5μm）with acetonitrile and water as mobile phases A and B for gradient elution（0－40min，A 19％；40－55min，A 19％－40％）at a flow rate of 1.2ml／min and a column temperature of 30℃.For ELSD parameters，the drift tube temperature was set at 50℃，70℃，90℃，or 110℃，and the carrier gas flow rate was set at 1.0L／min，1.2L／min，1.4L／min，or 1.6L／min.Results By contrast，the determination of three ginsenosides in Qibai Pingfei Capsules had the optimal results when Hypersil ODS XB－C8column was used as the analysis column，the drift tube temperature was set at 90℃，and the carrier gas flow rate was set at 1.2L／min.The average recoveries of ginsenosides Rg1，Re，and Rb1were 98.3％（RSD＝0.67％），99.1％（RSD＝1.03％），and 101.8％（RSD＝1.22％），respectively.Conclusion The HPLC－ELSD method using selected chromatographic column and optimized ELSD parameters has high accuracy and good repeatability in determining the content of ginsenosides Rg1，Re，and Rb1in Qibai Pingfei Capsules.

Qibai Pingfei Capsule；high－performance liquid chromatography－evaporative light－scattering detector；Ginsenoside；content determination

R284.1

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.027

2013－07－15）

安徽高校省級自然科學研究項目（KJ2011Z218）；安徽省中醫(yī)發(fā)展專項（皖中醫(yī)藥﹝2012﹞10號）；安徽中醫(yī)學院青年科學研究基金項目（2012qn020）

王斌（1983－），男，碩士

李澤庚，li6609＠126.com