有害藻華治理過程中改性粘土對仿刺參(Apostichopus japonicas Selenka)稚參的影響*

王志富 俞志明 宋秀賢① 曹西華 劉 楷

(1.中國科學院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室 青島 266071;2.中國科學院大學 北京 100049;3.中國海洋大學 青島 226003)

沿海經(jīng)濟的快速發(fā)展極大地改變了海岸帶的生態(tài)系統(tǒng),導致近海海域嚴重富營養(yǎng)化,使得沿海有害藻華發(fā)生頻率變高,影響范圍增大(Anderson,1997)。迄今為止,已經(jīng)有多種方法用于緩解和治理有害藻華。其中,黏土礦物絮凝方法因其資源豐富,成本較低等優(yōu)點得到了人們的重視(俞志明等,1994a),早在20世紀80年代就成為國際上治理有害藻華的常用方法(Shirota,1989)。它不僅能有效去除有害藻華生物,抑制藻毒素,還能吸附海水中的營養(yǎng)鹽(俞志明等,1995;Sengcoet al,2005),在實驗和實際應用中都取得了理想的治理效果。俞志明等(1994b)通過多年的研究,成功研制出了相對于天然黏土絮凝效率更高的改性黏土,并成功地應用到淡水和海水水體中,對于部分景區(qū)和養(yǎng)殖區(qū)的有害藻華應急治理起到了很好的效果(張哲海,2006)。

改性黏土技術得到成功應用的同時,人們也十分關注該方法的生態(tài)環(huán)境效應。前期研究表明,該技術在保持較高的除藻效率的同時,對中國對蝦(Penaeus chinensis)、日本對蝦(Penaeus japonicus)、雙眼鉤蝦(Palaemonetes pugio)、米諾魚(Cyprinodon variegatus)等游泳生物以及端足類動物(Ampelisca abdita,Leptocheirus plumulosus)、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)等養(yǎng)殖生物幾乎沒有影響(孫曉霞等,2000;Lewiset al,2003;曹西華等,2004;高詠卉等,2007a)。

仿刺參(Aposticopus japonieusSelenka)又名灰刺參,簡稱刺參,屬于海參綱(Holothuroidea)循手目(Aspidochirotidae)刺參科(Stichopodidae)仿刺參屬(Apostichopus),主要分布在中國黃渤海域、俄羅斯東部海岸、日本和韓國沿岸等。其作為我國海參種類中品質最佳的一種,既是一種美味的保健食品,又是一種具有藥用價值的海洋藥物(安振華,2008)。刺參體壁是其主要食用部分,該部分含有豐富的膠原成分和蛋白聚糖,并含有鈣、鎂鹽及鐵、錳等多種微量元素(薛素燕,2007)。其基本營養(yǎng)成分包括水分、灰分、蛋白質、糖類、總脂肪。鑒于其較高的經(jīng)濟和營養(yǎng)價值,目前仿刺參已成為我國近海廣泛養(yǎng)殖的海洋底棲經(jīng)濟物種。與其他養(yǎng)殖生物不同,仿刺參無法快速逃避沉降的黏土。所以,探明改性黏土技術對刺參生物的影響,對改性黏土技術進一步的廣泛應用、了解其對底棲生態(tài)環(huán)境的影響具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 改性黏土:同文獻(俞志明等,1994b)

1.1.2 生物培養(yǎng) 仿刺參取自即墨田橫鎮(zhèn),刺參稚參體長為1—2cm。在室內(nèi)水箱中暫養(yǎng)7天進行馴化,馴化過程中每天下午投喂一次餌料,并于下次投喂前用吸管清底,每日換水一次,溫度控制在 14—18°C,溶氧＞5.0mg/L,pH 7.8—8.2,鹽度30—31。實驗期間遮光培養(yǎng),間接充氣。

東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)為本實驗室培養(yǎng)提供。過濾海水 121°C高溫消毒滅菌 30min后,加入f/2去硅培養(yǎng)基進行單種培養(yǎng)。溫度(20±1)°C,光照 3000lux,光暗比 12h︰12h,選取達到對數(shù)生長期的藻體用于實驗。

1.2 改性黏土對仿刺參稚參的急性毒性試驗

先做預實驗,在10L過濾海水中放入10只稚參,分別加入200g/L的改性黏土懸浮液0、25、50、100、200、300、400、500mL,使得海水中改性黏土的濃度分別為 0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g/L,每個濃度設三個平行組。遮光,間歇通氣,停止投餌,96h后觀察刺參存活情況,確定出 100%致死濃度和不引起死亡的最大濃度分別為8.0g/L和4.0g/L。然后以此濃度范圍,按等對數(shù)間距確定5個濃度組,每組10只稚參,染毒96h。試驗期間保持水溫、溶解氧、pH值等的穩(wěn)定。最后運用直線內(nèi)插法求出刺參的半致死濃度。刺參稚參的死亡判斷標準是:身體柔軟,自然卷曲,管足及觸手收縮回體內(nèi),無附著能力,無活動及攝食能力,以玻璃棒輕碰之無反應(呂豪等,2005)。

1.3 改性黏土對仿刺參稚參的慢性毒性試驗

在40L過濾海水中放入30只稚參,分別加入0、20、100、200mL 20g/L的改性黏土懸浮液,使得海水中改性黏土的濃度分別為0、0.1、0.5、1.0g/L。每個濃度設兩個平行組。遮光,通氣,觀察,每24h換1/2的水,投喂適量餌料,不吸底。試驗持續(xù)暴露8周(或至空白組或實驗組刺參全部死亡為止),每 2周取樣一次,測定稚參的存活率和體重,并計算這段時間稚參的體重增長率。測量時,先將刺參取出,放于干毛巾上靜置 20min,使其體腔內(nèi)的水排出并吸干其體表水分,再將刺參稚參放于電子天平稱上稱重。稱完后,立即將刺參稚參放入換水后的玻璃缸中(王印庚等,2010)。

式中,MRGR為平均體重增長率;m0為初始體重;m1為實驗末體重。

慢性毒性試驗結束后,根據(jù)國家檢測標準,進行刺參體壁營養(yǎng)測定,包括水分(GB/T5009.3—2010)、灰分(GB/T5009.4—2010)、總蛋白(GB/T5009.5—2003)、脂肪(GB/T5009.6—2003)、糖分(GB/T9695.31—2008),分析不同改性黏土濃度下刺參體壁營養(yǎng)成分的變化。并根據(jù)張志勝等(2008)的方法測定不同改性黏土濃度下刺參體壁鋁含量的變化,了解改性黏土絮凝法對刺參含鋁量的影響。測樣時,從?20°C冰箱取出刺參,用剪刀剪成小塊,搗碎,按編號裝入塑封袋備用。

1.4 室內(nèi)模擬去除有害藻華生物時對刺參稚參的影響

為了模擬刺參養(yǎng)殖現(xiàn)場營養(yǎng)鹽濃度,在10L過濾滅菌海水中按照 f/20配比加入營養(yǎng)鹽單種培養(yǎng)東海原甲藻。當藻體達到指數(shù)生長期時(約2×104cell/mL),隨機加入 10只刺參稚參(1—2cm)。溫度控制在14—18°C,溶氧＞5.0mg/L,馴化適應 24 小時。停止充氣,分別加入20g/L的改性黏土懸浮液0、20、100mL,使改性黏土的濃度為 0、0.10、0.50g/L,每個濃度梯度3個平行樣。4小時后測定藻密度。待改性黏土絮凝物完全沉淀 24小時后恢復通氣。溫度控制在14—18°C,溶氧＞5.0mg/L,保持光照為自然光,強度為40—400lux。測96h急性毒性試驗刺參稚參的存活率,每 24h記錄刺參存活數(shù),生長狀態(tài)。實驗進行12d(或至空白組或實驗組刺參全部死亡為止),實驗結束時統(tǒng)計存活率。

2 結果與討論

2.1 改性黏土對仿刺參稚參的急性毒性試驗

根據(jù)96h急性毒性試驗所得實驗數(shù)據(jù),運用直線內(nèi)插法求得半致死濃度(LC50)為 6.01g/L(圖1),應用經(jīng)驗公式即 96h半致死濃度(96hLC50)×0.1系數(shù)所得的安全濃度為 0.601g/L,高于現(xiàn)場使用過程中的0.1g/L使用量。在實驗中觀察發(fā)現(xiàn),改性黏土在<1.0g/L濃度范圍內(nèi)刺參貼壁生活,狀態(tài)良好,刺完全伸展,未出現(xiàn)不良反應;改性黏土濃度到達 2.0g/L時,刺參吸附能力減弱,刺完全伸展,但略有浮腫;改性黏土濃度達到 4g/L時刺參的吸附能力都有不同程度變?nèi)?運動能力降低明顯,刺伸展不完全、浮腫;當改性黏土濃度在 8g/L以上時,刺參 96h后全部死亡。原因可能是高濃度的改性黏土沉降后附著在刺參的體壁和腕足上,還有部分改性黏土被刺參吸入呼吸樹中,導致刺參缺氧死亡。

圖1 96小時急性毒性試驗Fig.1 Test on acute toxicity in 96 h

2.2 改性黏土對仿刺參稚參的慢性毒性試驗

慢性毒性試驗具有以下優(yōu)點:(1)自然環(huán)境中,在污染物中長期暴露比急性暴露更常見;(2)沉積物中適度的污染物濃度比高濃度的污染物更普遍;(3)生理反應比致死率更能有效地反應污染物對環(huán)境和生物體的影響。所以,慢性毒性試驗能更有效的反映對生物體的實際影響(USEPA,1986)。研究表明改性黏土使用濃度在 0.10g/L時對東海原甲藻藻體的 24h去除率在 95%以上,另參照急性毒性試驗的觀察結果,在改性黏土施用濃度為0.0—1.0g/L范圍內(nèi)刺參未出現(xiàn)不良反應。所以慢性毒性試驗中設置的濃度梯度為0.0、0.1、0.5、1.0g/L,以進一步觀察分析改性黏土對刺參體重增長率、體壁營養(yǎng)組分、含鋁量的影響。

2.2.1 改性黏土對仿刺參存活率和體重增長率的影響 60天慢性毒性試驗中改性黏土對刺參存活率和體重增長率的影響如表1所示,添加改性黏土組刺參體重增長率較對照組略高。分別把實驗組與對照組做單側t檢驗,發(fā)現(xiàn)P均大于0.1,說明改性黏土對刺參體重增長沒有明顯影響。另對該實驗數(shù)據(jù)做單因素方差分析,得P=0.857,說明各種濃度的改性黏土對刺參體重的影響也無差異。由此可見,各濃度改性黏土對刺參的存活和生長略有干擾,但無明顯影響。

表1 慢性毒性試驗仿刺參稚參的生長狀況Tab.1 The growth of infant Aposticopus japonieus Selenka in chronic toxicity test

另通過觀察刺參狀態(tài)發(fā)現(xiàn)所有添加改性黏土實驗組的稚參,生活狀態(tài)均會隨著時間的推移變得越來越好。說明刺參對適宜計量的黏土會產(chǎn)生一定程度的耐受性。

從標準差來看,8周后的標準差明顯比剛開始時大很多,說明各組刺參體重均出現(xiàn)了較嚴重的兩極分化。在開始時,實驗組的標準差比對照組都大,而 8周后相比對照組明顯變小,說明改性黏土能降低刺參體重的兩極分化,即降低刺參的種內(nèi)競爭。有文獻指出,刺參這種低等的棘皮動物具有明顯的社會等級行為(梁淼,2010)。大的刺參社會等級高,有競爭優(yōu)勢。實驗中,為了盡量不攪動黏土,每次少量喂食,有可能無法滿足所有刺參的攝食量。因為刺參種群中的社會等級關系,造成了刺參體重兩極分化嚴重。刺參食用改性黏土的現(xiàn)象,推測是實驗組體重增長率大于對照組以及種內(nèi)競爭緩解的原因。即改性黏土絮凝了水體中的有機物后被刺參食用,抵消了部分飼料不足的影響,因此降低了種內(nèi)競爭。

2.2.2 改性黏土對刺參體壁營養(yǎng)成分的影響 在加入了不同濃度改性黏土的海水中培養(yǎng) 60天后,濕重條件下,刺參體壁的營養(yǎng)組分含量如圖2所示。所有數(shù)據(jù)的測定操作步驟和試劑均嚴格按照之前的標準方法,其中總蛋白含量測定中,其0.0— 10.0μg/mL氨氮標準曲線方程為y=0.0121x+0.0146(R2=0.9989);總糖含量測定中其0.0—5.0μg/mL葡萄糖標準曲線方程為y=0.0069x+0.0178(R2=0.9928)。

(1)對不同濃度改性黏土條件下刺參體壁水分和灰分含量進行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)P=0.8198(P>0.05),差異不顯著。說明不同濃度改性黏土的使用對刺參體壁水分和灰分含量不會造成明顯影響(如圖2a)。

圖2 不同改性黏土濃度下刺參體壁營養(yǎng)成分含量Fig.2 The nutrition content in modified clay of different concentrations

(2)對不同濃度改性黏土條件下刺參體壁蛋白質含量進行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)P=0.2686(P>0.05),差異不顯著。說明不同濃度改性黏土的使用對刺參體壁蛋白質含量不會造成明顯影響(如圖2b)。

(3)對不同濃度改性黏土下刺參體壁脂肪含量,發(fā)現(xiàn)P=0.2326(P>0.05),沒有顯著性差異。說明不同濃度改性黏土的使用對刺參體壁脂肪含量不會造成明顯影響(如圖2c)。

(4)對不同濃度改性黏土條件下刺參體壁糖含量進行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)P=0.5490(P>0.05),沒有顯著性差異。說明不同濃度改性黏土的使用對刺參體壁糖含量不會造成明顯影響(如圖2d)。

綜上所述,改性黏土濃度在 0.10—1.00g/L范圍內(nèi),對刺參體壁營養(yǎng)組分包括水分、蛋白質、糖分、脂肪、灰分的含量均無明顯影響,不會造成刺參營養(yǎng)價值流失。

2.2.3 改性黏土的使用對刺參體壁含鋁量的影響 圖3是不同濃度改性黏土劑量下培養(yǎng)刺參60天后刺參體壁中鋁的含量。和對照相比較,0.5g/L和1.0g/L濃度的改性黏土劑量條件下,刺參體壁中鋁含量略有下降;0.1g/L濃度的改性黏土劑量條件下,刺參體壁中鋁含量較對照組高,但差別都不大。對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析得P=0.2517(P>0.05),分別將實驗組黏土濃度0.1、0.5g、1.0g/L刺參鋁含量和對照組做t檢驗,所得P值為0.3208、0.2530、0.1599,結果均認為改性黏土在 0.0—1.0g/L范圍內(nèi)對刺參體壁鋁含量無明顯影響。

圖3 不同改性黏土濃度下仿刺參鋁含量Fig.3 The aluminum content in modified clay of different concentrations

2.3 室內(nèi)模擬改性黏土去除有害藻華時對刺參的影響

上述急性和慢性毒性試驗是在沒有有害藻華存在條件下進行的。在兩者都存在的條件下,進行了室內(nèi)小型的模擬實驗,以檢測黏土-有害藻體復合物對仿刺參稚參的影響。在放養(yǎng)刺參的有害藻華水體(東海原甲藻密度約 2.0×104cell/mL)中分別投加 0.1、0.5g/L濃度的改性黏土,停止通氣24小時,待黏土絮凝物完全沉底,恢復通氣,定時測定水體中的藻密度變化。圖4為96h水體中藻密度隨時間變化的情況。結果表明 0.1g/L改性黏土已可以有效抑制東海原甲藻的生長,4小時內(nèi)藻密度由初始的1.61×104cell/mL降低至 0.33×104cell/mL,去除率達到 80%,72h后水體中藻密度幾乎降為0。0.5g/L改性黏土在4h內(nèi)幾乎可以去除所有的東海原甲藻(如圖4)。

圖4 改性黏土96h內(nèi)對東海原甲藻的去除Fig.4 Removal of Prorocentrum donghaiense with modified clays in 96h

實驗過程中觀察刺參的生活狀態(tài),發(fā)現(xiàn)停止通氣的24h內(nèi),對照組刺參刺伸展完全、有攝食藻的行為,但有半數(shù)的刺參狀態(tài)不活躍;0.1g/L實驗組刺參狀態(tài)良好,少數(shù)出現(xiàn)不活躍,有攝食行為;0.5g/L實驗組刺參刺伸展,但半數(shù)的刺參不活躍,無明顯攝食行為?？梢?高濃度(0.5g/L)改性黏土對刺參還是有一定影響。然而在不通氣狀態(tài)下,刺參也可能受溶解氧濃度較低的影響,出現(xiàn)不活躍的現(xiàn)象(李剛,2010)。實驗96h過程中所有刺參的攝食情況都在減弱,96h后對照組刺參的生長狀態(tài)變差,刺伸展不完全,不活躍,無攝食,但未出現(xiàn)死亡;兩個實驗組刺參活躍狀態(tài)良好,無不良反應,未出現(xiàn)死亡。實驗繼續(xù)進行到第9天,對照組藻密度快速升高,水體顏色變黃,40%刺參死亡;0.1g/L實驗組3.33%刺參死亡;0.5g/L實驗組6.67%死亡。第10天對照所有刺參均死亡,0.1g/L實驗組刺參死亡率為3.33%,0.5g/L實驗組死亡率為6.67%(表2)。

由此可見,改性黏土可以顯著改善有害藻華爆發(fā)時刺參的生存環(huán)境,不同培養(yǎng)條件下的刺參存活率從高到低依次是 0.1g/L實驗組>0.5g/L實驗組>對照組。有文獻指出,在治理有害藻華的過程中改性黏土不僅能有效的絮凝有害藻體,還能降低水體中的營養(yǎng)鹽氮、磷的含量,且有助于降低某些藻毒素的產(chǎn)生,適當增加溶解氧的含量(高詠卉等,2007b)。改性黏土絮凝物沉降后對藻體形成了有效地包埋,增加了水體透明度,延緩了水質變壞速度。同時,實驗發(fā)現(xiàn)絮凝體的存在方便了刺參的食用。而對照組由于藻體的大量爆發(fā)與死亡,造成氧氣過度消耗,死亡藻體及刺參排泄物的降解易使水體狀況變差,引發(fā)刺參大量死亡。綜上所述,使用改性黏土治理有害藻華對刺參基本沒有影響,是一種安全可靠的方法。在使用過程中,建議可以采取多次少量的黏土添加方式。

表2 室內(nèi)模擬實驗刺參死亡率Tab.2 Mortality ratio of infant Aposticopus japonieus Selenka

3 結論

(1)改性黏土對刺參半致死濃度(LC50)為6.01g/L。根據(jù)水體中藥物安全濃度評價的經(jīng)驗公式,常用的安全系數(shù)為 0.1,以此計算改性黏土對刺參的安全濃度為0.601g/L,高于我們在使用過程中的0.1g/L使用量,這說明適量的改性黏土是可以應用在刺參養(yǎng)殖水體中的。

(2)改性黏土濃度在0.10—1.00g/L范圍內(nèi),其使用對刺參的存活率沒有明顯影響,同時對刺參體重增長率不會造成明顯影響。另通過觀察刺參狀態(tài)發(fā)現(xiàn),刺參對適宜劑量濃度的黏土會產(chǎn)生一定程度的耐受性。從標準差來看,改性黏土能降低刺參體重的兩極分化,即降低刺參的種內(nèi)競爭。

(3)改性黏土濃度在 0.10—1.00g/L范圍內(nèi),其對刺參體壁營養(yǎng)組分包括水分、蛋白質、糖分、脂肪、灰分的含量均無明顯影響,不會造成刺參營養(yǎng)價值流失。而且,改性黏土對刺參體壁含鋁量無顯著影響。

(4)0.1g/L和0.5g/L濃度的改性黏土,對東海原甲藻的去除均有良好效果,且有助于刺參的良好生長,僅會由于刺參對突加黏土造成的暫時不適影響其攝食。因此在改性黏土的實際使用中,要根據(jù)具體的有害藻種和藻密度調(diào)整改性黏土添加方式和使用劑量。

綜上,用改性黏土絮凝法治理有害藻華安全可靠,可以運用于仿刺參養(yǎng)殖場的有害藻華治理,建議現(xiàn)場可采取多次少量的噴灑策略。

致謝本研究中刺參稚參樣品的獲取得到了中國科學院海洋研究所生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室張濤老師和邱天龍博士的支持和幫助,謹致謝忱。

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