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      層層自組裝法制備雙重修飾脂質(zhì)體及其體外消化穩(wěn)定性

      2014-03-08 05:39:52鄒立強(qiáng)劉瑋琳
      食品科學(xué) 2014年15期
      關(guān)鍵詞:黃綠脂質(zhì)體海藻

      劉 珍,鄒立強(qiáng),劉 偉*,劉瑋琳,牛 靜

      (南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

      層層自組裝法制備雙重修飾脂質(zhì)體及其體外消化穩(wěn)定性

      劉 珍,鄒立強(qiáng),劉 偉*,劉瑋琳,牛 靜

      (南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

      以粒徑、電位、包覆率、沉淀量為指標(biāo),采用層層自組裝法制備海藻酸鈉(sodium alginate,AL)、殼聚糖(chitosan,CH)雙重修飾脂質(zhì)體海藻酸鈉-殼聚糖-脂質(zhì)體(AL-CH-L),研究AL-CH-L的物化性質(zhì)、微觀形貌及其體外消化穩(wěn)定性。結(jié)果表明:0. 6%殼聚糖和0.5%海藻酸鈉制備的AL-CH-L平均粒徑為(330.6±37.3)nm,分布集中,Zeta電位為(-15.8±0.7)mV,透射電鏡觀察雙重修飾脂質(zhì)體的外層成功包裹了海藻酸鈉和殼聚糖聚合物,呈現(xiàn)典型的核-殼結(jié)構(gòu)。以鈣黃綠素為熒光標(biāo)記物對(duì)未修飾和雙重修飾脂質(zhì)體進(jìn)行體外消化實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明雙重修飾脂質(zhì)體表現(xiàn)出更高的體外消化穩(wěn)定性。

      雙重修飾脂質(zhì)體;殼聚糖;海藻酸鈉;層層自組裝;消化穩(wěn)定性

      脂質(zhì)體(liposome)是由磷脂雙分子層形成的內(nèi)部包含水相的封閉囊泡[1],具有緩釋性、細(xì)胞親和性、組織相容性和靶向性等優(yōu)點(diǎn)[2],已成功應(yīng)用于生物醫(yī)藥、化工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]。脂質(zhì)體用于包裹營(yíng)養(yǎng)素、酶、食品添加劑、食品抗菌劑等食品運(yùn)載體系顯示出誘人前景[4], 然而脂質(zhì)體作為一種微粒分散體系,在貯藏過(guò)程中存在著 顆粒絮凝、粒徑易變大、藥物滲漏等問(wèn)題[2]。近年來(lái),為了增加脂質(zhì)體雙層膜結(jié)構(gòu)和體內(nèi)外釋放的穩(wěn)定性,通過(guò)物理化學(xué)作用在脂質(zhì)體表面包覆蛋白、多糖或者其他物質(zhì)來(lái)修飾脂質(zhì)體的研究成為熱點(diǎn)。自組 裝技術(shù)是分離或交聯(lián)的組分在適當(dāng)條件下自發(fā)地形成有序結(jié)構(gòu)的過(guò)程[5],層層自組裝技術(shù)是基于溶液中帶有相反電荷的物質(zhì)交替吸附形成自組裝多層膜,由于這種技術(shù)操作條件的溫和性(室溫、常壓和在水溶液中進(jìn)行)和對(duì)物化性質(zhì)的可控性,使得其發(fā)展迅速[6]。本實(shí)驗(yàn) 在采 用動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)制備納米脂質(zhì)體(nano liposomes,NL)改善其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上[7],進(jìn)一步采用聚電解質(zhì)層層自組裝技術(shù),以海藻酸鈉(algin,AL)中分子鏈上大量的羧基為負(fù)電荷,以殼聚糖(chitosan,CH)分子鏈上大量的伯氨基為正電荷,通過(guò)正、負(fù)電荷靜電作用層層交替形成聚電解質(zhì)膜,組裝在納米脂質(zhì)體模板表面。殼聚糖和海藻酸鈉是存在于自然界中天然線性多糖[8],一些學(xué)者對(duì)殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合物修飾運(yùn)載體系進(jìn)行了研究,如Ai yuefei等[9]制備了殼聚糖-海藻酸鈉微膠囊;Tarane等[10]制備了海藻酸鈉-殼聚糖納米顆粒,但是基于殼聚糖與海藻酸鈉雙重修飾脂質(zhì)體的研究依舊甚少。

      消化穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體性質(zhì)以及應(yīng)用的重要指標(biāo),其又分為體內(nèi)消化穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性,其中體外消化穩(wěn)定性主要是通過(guò)模擬人體胃腸液環(huán)境來(lái)展開(kāi)研究。Parmentier等[11]利用模擬人體腸液以脂質(zhì)體粒徑和磷脂的消化變化來(lái)研究了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性;Carafa等[12]利用一種多糖對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行修飾,研究了其在模擬胃腸道環(huán)境中的釋放性;Filipovic-Grcic等[13]制備了殼聚糖-脂質(zhì)體,證實(shí)了其在模擬胃液中的穩(wěn)定性高于未修飾脂質(zhì)體。前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察不同來(lái)源磷脂制備的脂質(zhì)體在體外消化過(guò)程中粒徑、電位、微觀結(jié)構(gòu)和膜滲透性等的變化,研究了脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)完整性[14-15]。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,雙重修飾脂質(zhì)體的體外消化穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步展開(kāi)。

      本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)制備NL,以粒徑、電位、分散系數(shù)、包覆率和沉淀量為指標(biāo),根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)質(zhì)量濃度的CH-L后再優(yōu)化制備海藻酸鈉-殼聚糖-脂質(zhì)體(AL-CH-L),并對(duì)AL-CH-L的物化性質(zhì)(粒徑、電位、分散系數(shù)、微觀形貌等)進(jìn)行表征;同時(shí)采用熒光標(biāo)記技術(shù),通過(guò)考察包覆于脂質(zhì)體內(nèi)部的熒光物質(zhì)鈣黃綠素的釋放[16]和脂質(zhì)體粒徑、電位的變化比較了AL-CH-L和NL的體外消化穩(wěn)定性。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      大豆磷脂(P3644)、膽固醇(C75209)、殼聚糖(448869)、海藻酸鈉(A0682)、胃蛋白酶(P7125)、胰液素(P1750)、鈣黃綠素(C0875)美國(guó)Sigma公司;乙醇、VE、吐溫-80等均為分析純;磷酸緩沖液(pH 7.4)。

      1.2 儀器與設(shè)備

      動(dòng)態(tài)超高壓均質(zhì)機(jī)(微射流) 廊坊通用機(jī)械有限公司;RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;NICOMP380/ZLS激光納米粒度分析儀 美國(guó)PSS公司;D37520高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific公司;Delta320 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器(中國(guó))有限公司;Tecnai G2 Spirit透射電鏡 日本Jeol公司;Agilent 5500原子力顯微鏡 美國(guó)Agilent公司;電子分析天平奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司;IKA RCT磁力攪拌器、漩渦混勻器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;FP-6200熒光光度計(jì) 日本Jasco公司。

      1.3 方法

      1.3.1 空白NL的制備

      根據(jù)Bangham等[17]方法制備粗脂質(zhì)體:將磷脂、膽固醇、吐溫-80和VE按照質(zhì)量比6∶1∶1.8∶0.12混合加入無(wú)水乙醇中,在40 ℃條件下用磁力攪拌器混勻,待脂類物質(zhì)完全溶解后于真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇形成薄膜,加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗膜,得到粗脂質(zhì)體懸濁液。在120 MPa壓力下經(jīng)動(dòng)態(tài)高壓微射流處理二次即得到納米脂質(zhì)體[7]。

      1.3.2 CH-L的制備

      CH-L的制備參考Mady[18]、Gonzaléz-Rodríguez[19]等的方法,分別取不同質(zhì)量濃度的pH 5.5的殼聚糖溶液(0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 g/100 mL)按照體積比1∶1進(jìn)行修飾脂質(zhì)體,將脂質(zhì)體緩慢滴入殼聚糖溶液中,邊攪拌邊加入,滴加完畢后使用NaOH、HCl稀溶液調(diào)節(jié)CH-L的pH 5.5,靜置1 h讓其充分反應(yīng)。以粒徑、電位和包覆率為指標(biāo),考察并分析確定最優(yōu)質(zhì)量濃度的殼聚糖,得到最優(yōu)配方的CH-L。其中,利用試劑盒方法進(jìn)行包覆率的測(cè)定[20]:取適量的殼聚糖包覆的脂質(zhì)體溶液在15 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心1 h,使包覆的CH-L充分沉淀。用等體積的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀,得到CH-L溶液。通過(guò)測(cè)定離心前后的磷脂含量來(lái)確定CH-L的制備的優(yōu)化工藝。按照式(1)計(jì)算包覆率。

      式中:m為沉淀物中磷脂含量/g;m0為總磷脂含量/g。

      1.3.3 AL-CH-L的制備

      在優(yōu)化條件下制備CH-L樣品基礎(chǔ)上,分別取不同質(zhì)量濃度的pH 5.5的海藻酸鈉溶液(0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 g/100 mL)進(jìn)行第2層修飾脂質(zhì)體,按照體積比1∶1,將最優(yōu)配方的CH-L,逐滴加入至海藻酸鈉溶液中,邊攪拌邊加入,滴加完畢后使用NaOH、HCl稀溶液調(diào)節(jié)AL-CH-L溶液的pH值至5.5,靜置1 h讓其充分反應(yīng)。得到的雙重修飾脂質(zhì)體在3 000×g離心15 min,過(guò)濾后稱量沉淀物質(zhì)量。以粒徑、電位和沉淀量為指標(biāo),確定最優(yōu)質(zhì)量濃度的海藻酸鈉。利用稱量法按式(2)計(jì)算得到沉淀的質(zhì)量。

      式中:m1為離心管與沉淀的總質(zhì)量/g;m0為離心管質(zhì)量/g;m為沉淀的質(zhì)量/g。

      1.3.4 AL-CH-L的性質(zhì)表征

      1.3.4.1 平均粒徑、分散系數(shù)和表面電荷的測(cè)定

      取適量AL-CH-L用磷酸緩沖液稀釋3倍,未修飾的脂質(zhì)體稀釋10倍,利用NICOMP380/ZLS激光納米粒度分析儀測(cè)定平均粒徑、分散系數(shù)及Zeta電位。

      1.3.4.2 微觀形貌的表征

      利用原子力顯微鏡和透射電鏡觀察AL-CH-L和未修飾脂質(zhì)體的微觀形態(tài)特征。將稀釋適當(dāng)倍數(shù)后的樣品滴加到云母片上,室溫過(guò)夜干燥后置于原子力顯微鏡下觀察。將適量稀釋后的樣品,滴于銅網(wǎng)上,使用2%醋酸鈾負(fù)染4 min,過(guò)量的液體用濾紙吸干,室溫干燥后置于透射電鏡下觀察脂質(zhì)體形態(tài)。

      1.3.5 AL-CH-L的體外消化穩(wěn)定性研究

      模擬胃液的制備:2 g氯化物溶解于蒸餾水中,加入濃鹽酸,稀釋至1 L,調(diào)節(jié)pH 1.2;模擬腸液的制備:6.8 g K2HPO4溶190 mL 0.1 mol/L NaOH中,膽汁質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL,稀釋至1 L,調(diào)節(jié)pH 7.4。在消化實(shí)驗(yàn)之前,模擬胃液與模擬腸液放置在37 ℃恒溫水浴中95 r/min持續(xù)攪拌[21]。

      鈣黃綠素的釋放率[14]:制備熒光標(biāo)記物鈣黃綠素的納米脂質(zhì)體,方法參照1.3.1節(jié),同時(shí)采用殼聚糖、海藻酸鈉對(duì)其進(jìn)行雙重修飾得到AL-CH-L。AL-CH-L與模擬胃液或模擬腸液按體積比4∶3混合,未修飾的脂質(zhì)體則按照體積比1∶3加入模擬胃液、模擬腸液,37 ℃恒溫水浴振蕩,分別從加入胃蛋白酶、胰蛋白酶液時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),每隔0、1、5、15、30、60、120 min取出適當(dāng)樣品,使用熒光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度,按式(3)計(jì)算鈣黃綠素的釋放率。

      式中:It為時(shí)間t測(cè)定的熒光強(qiáng)度;I0為0 min時(shí)的熒光強(qiáng)度;Imax加入2%曲通破乳后測(cè)定的總熒光強(qiáng)度。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 AL-CH-L的制備條件優(yōu)化

      圖1 CH-L的粒徑、電位、包覆率隨CH質(zhì)量濃度的變化Fig.1 Changes in particle size, zeta potential and coating efficiency of CH-L with chitosan concentration

      CH修飾后改變了納米脂質(zhì)體的粒徑分布、帶電性和包覆率。由圖1可知,未修飾的NL粒徑為(79.8±3.8)nm,表面帶有負(fù)電荷為(-6.7±1.2) mV,隨著CH質(zhì)量濃度的增大,C H-L的平均粒徑逐漸增大至(255.8±34.8) nm;Zeta電位由負(fù)電反轉(zhuǎn)為正電,當(dāng)CH質(zhì)量濃度為0.6 g/100 mL時(shí),電位增大至(2.3±0.7)mV。隨后變化不大;同時(shí),當(dāng)CH質(zhì)量濃度為在0.1 g/100 mL時(shí),CH-L的包覆率曲線達(dá)到拐點(diǎn)隨后趨于平穩(wěn)。然而,由于0.1 g/100 mL CH修飾得到的CH-L帶電量?jī)H為(-0.075±1.1)mV,接近中性,與AL的靜電作用則很弱。綜合分析粒徑分布、帶電性和包覆率等指標(biāo),確定使用0.6 g/100 mL的CH為制備單層修飾脂質(zhì)體CH-L的最佳質(zhì)量濃度。

      CH是由甲殼素經(jīng)脫乙酰作用得到的α-(1,4)-2-氨基-β-D-葡萄糖,結(jié)構(gòu)中含有大量的伯氨基—NH2,由于CH-NH3+的pKa值為6.5[22],在本實(shí)驗(yàn)中,制備的NL其疏水尾部聚集在一起,親水頭部暴露在水相,磷脂雙分子層的表面極性頭帶有負(fù)電而使用pH 5.5的CH進(jìn)行第一層修飾時(shí),按Motwani等[23]報(bào)道,在此pH值條件下,CH氨基質(zhì)子化得到-NH3+,形成陽(yáng)離子聚合物,通過(guò)靜電作用或疏水作用與脂質(zhì)體的磷脂極性頭結(jié)合[24],從而在NL表面形成穩(wěn)定的離子-聚合物層獲得CH-L。

      由于CH在胃液的強(qiáng)酸性環(huán)境中溶解性很強(qiáng),單純的采用CH修飾脂質(zhì)體并不能滿足提高其穩(wěn)定性的需要,因此本實(shí)驗(yàn)采用AL再次修飾pH 5.5的CH-L。AL是β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接形成的一類線性鏈狀陰離子聚合物[10],呈堿性,當(dāng)加入高pH值的AL時(shí),CH的質(zhì)子化程度減弱并且會(huì)沉淀析出,所以調(diào)節(jié)AL使其pH值為5.5,在此條件下AL的羧基離子化形成—COO-[23]。并且調(diào)節(jié)雙重修飾后的溶液使其pH值依舊為5.5,在pH 5.5的條件下,CH的氨基質(zhì)子化形成-NH3+和AL羧基離子化形成—COO-,二者通過(guò)靜電作用在修飾脂質(zhì)體(CH-L)的外層上層層組裝形成聚合物層(AL-CH)而獲得雙重修飾脂質(zhì)體AL-CH-L。在實(shí)驗(yàn)中,AL修飾后,AL-CH-L的粒徑分布和帶電量發(fā)生再次改變,并且AL與游離的CH之間形成大量的聚合物導(dǎo)致了沉淀的產(chǎn)生。

      圖2 AL-CH-L的粒徑、電位、沉淀量隨AL質(zhì)量濃度的變化Fig.2 Changes in particle size, zeta potential and sedimentation amount of AL-CH-L with sodium alginate concentration

      由圖2可知,當(dāng)AL質(zhì)量濃度低于0.5 g/100 mL時(shí),得到的AL-CH-L的帶電量較低;當(dāng)AL質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL時(shí),AL-CH-L的粒徑為(330.6±37.3)nm,帶電量達(dá)到最大(-15.8±0.7)mV;當(dāng)AL質(zhì)量濃度繼續(xù)增大至2.5 g/100 mL,粒徑突變達(dá)到(3 229.7±203.4)nm,且分散很不均勻,系數(shù)達(dá)到0.8。另外,從制備過(guò)程中沉淀量的變化曲線可知,當(dāng)AL附著在CH-L外層時(shí),沉淀量隨著AL的質(zhì)量濃度增加發(fā)生變化。在低質(zhì)量濃度的AL加入時(shí),AL修飾CH-L的程度較低,隨著質(zhì)量濃度增大到0.5 g/100 mL時(shí),AL與CH-L的結(jié)合增強(qiáng),同時(shí)AL與游離的CH作用同步增強(qiáng),導(dǎo)致形成的沉淀量增加。隨著體系中AL質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大至1 g/100 mL,制備得到的AL-CH-L粒徑達(dá)到(1 170.3±404.5) nm,并且其帶電量低于0.5 g/100 mL AL-CH-L。此時(shí)AL與游離的CH作用愈加明顯,其相互纏結(jié)的更為緊密,導(dǎo)致暴露的帶電基團(tuán)減少,體系中的帶電量的減少引起聚合物之間相互排斥力的減弱,故而1 g/100 mL AL修飾時(shí)形成的相對(duì)沉淀量增加到最大。此后相對(duì)沉淀量一直減小,這可能是由于AL的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大,纏結(jié)的沉淀更為緊致導(dǎo)致其吸收的水分更少,故而引起相對(duì)沉淀物的質(zhì)量逐漸減小。由此綜合分析確定0.5 g/100 mL AL制備AL-CH-L效果最佳。

      2.2 AL-CH-L的微觀形貌

      利用激光納米粒度儀,原子力顯微鏡和透射電鏡,以未修飾的NL作為對(duì)照組,對(duì)制備的層層自組裝脂質(zhì)體AL-CH-L的微觀形貌進(jìn)行了表征。

      圖3 未修飾的NL(a)和AL-CH-L(b)的原子力顯微鏡3D圖Fig.3 Atomic force microscopic images of NL (a) and AL-CH-L (b)

      由圖3可知,NL顆粒清晰,粒徑為(79.8±3.8)nm,大小及分布皆比較均勻(圖3a);而制備的AL-CH-L粒徑較大,粒徑為(330.6±37.3)nm(圖3b)。溶液中除了突起的大顆粒AL-CH-L外,還有分散著許多附著物。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AL-CH-L制備過(guò)程中產(chǎn)生了些許沉淀物,原子力顯微鏡3D形貌同時(shí)也驗(yàn)證了制備過(guò)程中沉淀量的變化。

      圖4 未修飾的NL(a)和AL-CH-L(b)的透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron micrographs of NL (a) and AL-CH-L (b)

      由圖4可知,未修飾脂質(zhì)體NL呈球形,并且分布較均勻,可知其成型較好(圖4a);而雙重修飾脂質(zhì)體AL-CH-L呈球形,結(jié)構(gòu)完整,粒徑明顯大于未修飾的脂質(zhì)體,并且呈現(xiàn)出典型的核-殼結(jié)構(gòu),內(nèi)層為飽和度較高的亮白色,外層覆蓋上較為透明的聚合物層(圖4b)。據(jù)Mady等[18]報(bào)道,采用殼聚糖修飾薄膜分散法制備的脂質(zhì)體也會(huì)出現(xiàn)這樣的核-殼結(jié)構(gòu)。

      為進(jìn)一步驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)中AL-CH-L的形成,選擇實(shí)驗(yàn)中的AL-CH-L、CH-L和NL樣品進(jìn)行粒徑分布的對(duì)比,結(jié)果如圖5所示。

      圖5 NL、CH-L和AL-CH-L的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of nanoliposome, CH-L and AL-CH-L

      根據(jù)納米粒度儀測(cè)得的NL、CH-L和最優(yōu)配方下的AL-CH-L粒度分布圖(圖5)可知,修飾后的脂質(zhì)體粒徑明顯高于未修飾的脂質(zhì)體。NL的平均粒徑為(79.8±3.8)nm,CH-L的平均粒徑為(158.2±4.4)nm,這與Mady等[18]報(bào)道的殼聚糖修飾后的脂質(zhì)體粒徑較修飾前增大(92±27.1)nm一致,而本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上再次修飾上AL后,制備的AL-CH-L粒徑增加到(330.6±37.3)nm,明顯大于殼聚糖-脂質(zhì)體與納米脂質(zhì)體??梢?jiàn),AL-CH聚合物層的存在,明顯改變了脂質(zhì)體微粒的大小及分布。

      2.3 體外消化穩(wěn)定性

      在模擬人體胃腸液環(huán)境中,通過(guò)測(cè)定分析NL和AL-CH-L隨消化時(shí)間的性質(zhì)變化(平均粒徑、分散系數(shù)和Zeta電位)和包裹的熒光物質(zhì)鈣黃綠素的釋放曲線,從而比較脂質(zhì)體修飾前后的消化穩(wěn)定性。結(jié)果如表1和圖6所示。

      表1 NL和AL-CH-L在模擬胃腸液中消化120 min后的粒徑、分散系數(shù)和電位值Table 1 Particle size, PDI and zeta potential of NL and AL-CH-L after 120 min of digestion in SGF and SIF

      由表1結(jié)合2.2節(jié)的結(jié)果可知,在模擬人體胃液環(huán)境中消化120 min后,NL和AL-CH-L的粒徑和電位變化均較小,NL的粒徑由(79.8±3.8)nm變化為(8 0.2±6.3)n m,A L-C H-L的粒徑由(330.6±37.3)nm變化為(299.5±15.2)nm;NL的電位由(-6.7±1.2)mV變化為(-4.4±0.6)mV,AL-CH-L的電位由(-15.8±0.7)mV變化至(-17.9±0.2)mV,可見(jiàn)其均呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性,這與Rowland等[25]的報(bào)道一致,即大多數(shù)的脂質(zhì)體在通過(guò)胃液低pH值的環(huán)境時(shí)受到的影響較小。在模擬人體腸液環(huán)境中消化120 min后,兩種脂質(zhì)體則呈現(xiàn)不同的變化:NL粒徑由(79.8±3.8)nm增大為(124.1±12.1)nm,A L-C H-L的粒徑則由(3 3 0.6±3 7.3)n m變化至(5 1 3.6±1 5.0)n m;N L的電位由(-6.7±1.2)mV變化至(-32.2±6.0)mV,AL-CH-L的電位由(-15.8±0.7)mV變?yōu)椋?22.2±0.2)mV,可見(jiàn)NL電位明顯增大,其變化較AL-CH-L更為明顯。AL-CH-L在腸液中粒徑增大,可能是在pH 7.4的環(huán)境下,CH質(zhì)子化的程度降低,帶電量減少,CH與AL的靜電結(jié)合作用則減弱,導(dǎo)致了結(jié)構(gòu)的松散和溶液介質(zhì)滲透進(jìn)粒子內(nèi)部,故而粒徑增大;AL-CH-L消化120 min后帶電量沒(méi)有明顯變化,NL的帶電量則表現(xiàn)為明顯增大,原因可能是NL在胰蛋白酶和膽酸鹽的協(xié)同作用下,NL中磷脂的有序結(jié)構(gòu)容易被破壞,引起脂質(zhì)體的聚集融合,導(dǎo)致了粒徑的增大,同時(shí)磷脂的水解產(chǎn)物覆蓋在脂質(zhì)體表面或者破壞后的脂質(zhì)體與膽酸鹽結(jié)合形成囊泡,導(dǎo)致了其帶電量的增加[12],而AL-CH-L在腸液中,因?yàn)槭艿紸L-CH聚合物層的保護(hù),其電位變化較小。

      圖6 NL和AL-CH-L中鈣黃綠素在模擬胃腸液中的釋放Fig.6 Calcein release from nanoliposome and AL-CH-L in SGF and SIF

      由圖6可知,在SGF中,兩種脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)未受到太多破壞,鈣黃綠素的釋放量少且區(qū)別不是很明顯,均表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。然而,在腸液中,消化15 min后,NL中鈣黃綠素的釋放為(35±9)%,而AL-CH-L中其釋放率僅為(15±1)%,消化120 min后,NL中鈣黃綠素釋放率為(58±2)%,而AL-CH-L釋放率僅為(38±2)%,并且從整個(gè)釋放曲線可以看出,AL-CH-L中鈣黃綠素的釋放率始終明顯低于NL。在NL中,脂質(zhì)體中磷脂經(jīng)過(guò)水解,形成了不穩(wěn)定的微束結(jié)構(gòu)[12],導(dǎo)致了脂質(zhì)體膜的通透性增強(qiáng),故而鈣黃綠素的釋放增加。ALCH-L中鈣黃綠素釋放率的逐漸增加,可能是因?yàn)锳L屬于腸溶性壁材,在胃液中,制備的AL-CH-L因AL的不溶性保護(hù)了脂質(zhì)體,表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定;而在腸液中,AL逐漸溶解,包埋物也逐漸釋放。綜合分析可以看出,AL與CH在脂質(zhì)體外層形成的保護(hù)層,可以在一定程度上提高脂質(zhì)體在胃腸液中的穩(wěn)定性。

      3 結(jié) 論

      殼聚糖和海藻酸鈉作為天然多糖,具有良好的生物相容性、生物降解性、無(wú)毒性,可作為脂質(zhì)體安全的修飾劑材料。本實(shí)驗(yàn)采用層層自組裝技術(shù)成功制備了海藻酸鈉-殼聚糖雙重修飾脂質(zhì)體,通過(guò)原子力顯微鏡、透射電鏡和激光納米粒度儀對(duì)AL-CH-L的形貌和性質(zhì)進(jìn)行表征,并比較了修飾前后脂質(zhì)體的體外消化穩(wěn)定性,結(jié)果表明AL-CH-L較NL顯示出更好的體外消化穩(wěn)定性。后期可以研究包埋多種模型藥物來(lái)進(jìn)一步考察層層自組裝脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

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      Preparation and in vitro Digestive Stability of Double Modified Liposomes through Layer-by-Layer Self-Assembly

      LIU Zhen, ZOU Li-qiang, LIU Wei*, LIU Wei-lin, NIU Jing
      (State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

      Sodium alginate (AL) and chitosan (CH) were coated onto liposome through layer by layer self-assembly technique. The physicochemical and morphological characteristics and in vitro digestive stability of AL-CH-L were observed. The results showed that 0.6% CH and 0.5% AL were the best choice to prepare AL-CH-L. Thus, the AL-CH-L revealed a size of (330.6 ± 37.3) nm with a centralized distribution and a zeta potential of (-15.8 ± 0.7) mV, and a polymer fi lm was successfully coated on the surface of liposome as observed under a transmittance electron microscope (TEM). Meanwhile, an obvious core-shell structure was observed. The in vitro digestion experiment carried out using the fl uorescence marker calcein showed better digestive stability of AL-CH-L when compared with common nanoliposomes.

      double modif i ed liposome; chitosan; alginate; layer by layer self-assembly; digestive stability

      TS201.2

      A

      1002-6630(2014)15-0005-06

      10.7506/spkx10 02-6630-201415002

      2013-07-31

      國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(21266021);食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索項(xiàng)目(SKLF-ZZB-201311)

      劉珍(1991—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭澄铮ê镔|(zhì))資源的開(kāi)發(fā)與利用。E-mail:ncuskliuzhen@163.com

      *通信作者:劉偉(1972—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称犯咝录夹g(shù)與資源綜合利用。E-mail:liuwei@ncu.edu.cn

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