番石榴葉乙酸乙酯萃取物化學(xué)成分研究

歐陽(yáng)文，朱曉艾，邵祥輝，劉曉娟，劉潤(rùn)南，劉 欣，杜方麓，曹 庸,*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

番石榴葉乙酸乙酯萃取物化學(xué)成分研究

歐陽(yáng)文1，朱曉艾2，邵祥輝2，劉曉娟2，劉潤(rùn)南1，劉 欣2，杜方麓1，曹 庸2,*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

目的：尋找番石榴葉乙酸乙酯萃取物中具有降糖活性的功能成分。方法：采用硅膠、羥丙基葡聚糖凝膠柱層析與溶劑重結(jié)晶法進(jìn)行單體分離純化；通過(guò)分析化合物的理化性質(zhì)、核磁共振譜（nuclear magnetic resonance spectrum，NMR）、質(zhì)譜（mass spectrum，MS）數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；建立降糖脂肪細(xì)胞模型評(píng)價(jià)主要單體的降糖活性。結(jié)果：從番石榴葉乙酸乙酯萃取物中共分得14個(gè)單體化合物，分別鑒定為：金絲桃苷（化合物1）、異槲皮苷（化合物2）、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷（化合物3）、廣寄生苷（化合物4）、番石榴苷（化合物5），槲皮素-3-O-(2’-O-沒(méi)食子酰基）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷（化合物6），槲皮素（化合物7）、沒(méi)食子酸乙酯（化合物8）、齊墩果酸（化合物9）、β-谷甾醇（化合物10）、isocaryolan-9-one（化合物11）、(-)-epiglobulol（化合物12）、t-cadinol（化合物13）和muurola-4,10(14)-dien-1-ol（化合物14）。降糖脂肪細(xì)胞模型測(cè)定結(jié)果表明，5種主要黃酮苷均具有降糖活性，其中以番石榴苷和廣寄生苷降糖效果最好，40 μmol/L濃度下促葡萄糖攝取值分別達(dá)到了（1.74±0.076）、（1.81±0.029）mmol/L。結(jié)論：化合物6、8、11～14為首次從該植物中分得，化合物11為一新的天然產(chǎn)物；番石榴苷和廣寄生苷可能為番石榴葉主要降糖活性成分。

番石榴葉；黃酮類；倍半萜類；isocaryolan-9-one；化學(xué)成分；降糖活性

番石榴（Psidium guajava Linn.）為桃金娘科（Myrtaceae）番石榴屬（Psidium）果樹(shù)。番石榴具有降糖、止瀉、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、降血壓、保護(hù)心臟等多種藥用功效，因此作為一種民間藥物在全世界亞熱帶地區(qū)廣泛使用[1]。番石榴具有明顯的降糖作用，民間的廣泛應(yīng)用和大量的科學(xué)研究證明其具有較好的降糖效果且無(wú)毒副作用[2-6]，在日本，F(xiàn)OSHU（特定保健用食品）已有批準(zhǔn)作為防治2型糖尿病的含番石榴提取物的番石榴茶上市[7]。番石榴葉中化學(xué)成分種類豐富，含有三萜、黃酮、鞣質(zhì)、倍半萜、雜萜類、揮發(fā)油等多種結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分，其中三萜類化合物主要為烏蘇烷型和齊墩果烷型，黃酮類化合物主要為槲皮素和槲皮素為苷元的黃酮苷，除黃酮和鞣質(zhì)外，還可見(jiàn)新穎二苯甲酮苷類的多元酚類存在。從2007年以后不斷有新奇結(jié)構(gòu)的雜萜類化合物發(fā)現(xiàn)，因此對(duì)番石榴葉進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)成分和藥理活性研究具有重要意義[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)具有降糖功能的番石榴葉乙酸乙酯萃取物[2]進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，共分離得到14種單體化合物，其中化合物11（isocaryolan-9-one）為一種新的天然產(chǎn)物，同時(shí)通過(guò)建立降糖脂肪細(xì)胞模型，對(duì)主要黃酮苷類化合物的降糖活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番石榴葉，于2012年9月采自廣東省茂名市林業(yè)局，原植物經(jīng)湖南吉首大學(xué)廖博儒教授鑒定，為桃金娘科番石榴屬植物，植物標(biāo)本現(xiàn)存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院天然活性物研究中心；雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量120～150 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

薄層層析硅膠、柱層析硅膠（100～200目） 青島海洋化工廠；Sephadex LH-20 美國(guó)GE公司；常規(guī)提取分離用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；葡萄糖（glucose，GLU）測(cè)定試劑盒 廣州科方生物技術(shù)公司；胰島素、Ⅰ型膠原酶 美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、葡萄糖 廣州威佳生物公司；去酚紅Hanks緩沖液、青霉素-鏈霉素雙抗 杭州吉諾生物公司；腎上腺素 日本TCI公司；胎牛血清 杭州四季青公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600紫外-可見(jiàn)光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；INOVA-600 MHz高分辨超導(dǎo)核磁共振譜儀 瑞士Bruker公司；電子天平（萬(wàn)分之一） 美國(guó)梅特勒-托利多公司；Wallac VICTOR3-1420型酶標(biāo)儀 美國(guó)PE公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化公司；TC-2323二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)Sheldon公司；各種規(guī)格移液器 美國(guó)伯樂(lè)公司；1 200 L液相色譜/四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)瓦里安公司；AEI-MS-50型質(zhì)譜儀 美國(guó)AEI公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離純化

番石榴葉2 kg，粉碎，用12倍體積95%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）回流提取3次，60 ℃減壓回收溶劑，加適當(dāng)水分散，乙酸乙酯液充分萃取，減壓回收溶劑得乙酸乙酯浸膏45.9 g。取乙酸乙酯萃取浸膏40 g，經(jīng)硅膠常壓、低壓柱層析，重結(jié)晶及葡萄糖凝膠LH-20（SephadexLH-20）層析，共分離得到了14個(gè)單體化合物，分別為化合物1（25.5 mg）、2（17.4 mg）、3（30.3 mg）、4（117.9 mg）、5（105.3 mg）、6（6 mg）、7（124 mg）、8（8 mg）、9（17 mg）、10（25 mg）、11（6 mg）、12（14 mg）、13（11 mg）、14（7 mg）。

1.3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)所獲得的單體化合物，采用薄層層析或液相色譜檢測(cè)純度，測(cè)定單體化合物的紫外、核磁共振與質(zhì)譜圖，同時(shí)對(duì)獲得的波譜數(shù)據(jù)綜合解析，并與文獻(xiàn)比較進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

核磁共振測(cè)定中根據(jù)化合物的極性，分別選用氘代氯仿，氘代甲醇，氘代二甲基亞砜為溶劑，以四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS）為內(nèi)標(biāo)測(cè)定；質(zhì)譜測(cè)定中，電子轟擊質(zhì)譜（electron impact mass spectrometry，EI-MS）電離源為70 ev電子流，高分辨電噴霧質(zhì)譜（high resolution electrospray ionization mass spectrometry，HRESI-MS）采用電噴霧方式離解，陰離子模式。

1.3.3 乙酸乙酯萃取物與單體降糖活性測(cè)定

1.3.3.1 供試樣品的制備

將乙酸乙酯萃取物和單體化合物在無(wú)菌條件下，用體積分?jǐn)?shù)0.5% DMSO配制成各濃度的供試樣品溶液，并過(guò)0.22 μm微孔濾膜除菌。

1.3.3.2 脂肪細(xì)胞的分離純化

參照Rodbell[9]方法，略作修改：大鼠脫頸處死，75%酒精浴后無(wú)菌開(kāi)腹，取附睪外層白色脂肪組織，Hanks緩沖液漂洗2次并剔除附帶血管，再剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm，加入適量0.1%Ⅰ型膠原酶溶液，37 ℃水浴消化1.5 h后加入2～3倍體積的胎牛血清終止消化。細(xì)胞懸液1 200 r/min離心10 min棄下層溶液，上層脂肪細(xì)胞同法加Hanks緩沖液洗滌細(xì)胞2 次，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板，加入Hanks液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。

1.3.3.3 大鼠脂肪細(xì)胞降糖模型

參照Nishide等[10]方法，略作修改：在96孔板中建立200 μL反應(yīng)體系：濃度為2×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液100 μL，30 μL葡萄糖溶液（質(zhì)量濃度為1 mg/mL），30 μL胎牛血清，40 μL樣品溶液。在此模型中，用0.1% DMSO Hanks緩沖液做對(duì)照組，胰島素為陽(yáng)性對(duì)照。200 μL反應(yīng)體系培養(yǎng)30 min后，每孔加入終濃度為10-5mol/L腎上腺素，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，冰浴終止反應(yīng)。然后每孔精密吸取2 μL上清液，采用微量葡萄糖氧化酶法[11]顯色，在酶標(biāo)儀上（505 nm）讀數(shù)，測(cè)定并計(jì)算各孔葡萄糖濃度，通過(guò)建立工作曲線，并和對(duì)照組比較計(jì)算各組的葡萄糖消耗濃度，由此評(píng)價(jià)萃取物或單體的攝取葡萄糖能力，具體計(jì)算公式如下：

葡萄糖攝取水平= c對(duì)照組-c供試組

式中：c對(duì)照組為對(duì)照組葡萄糖濃度/（mmol/L）；c供試組為樣品或分離得到的單體經(jīng)過(guò)3 h培養(yǎng)后殘留培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度/（mmol/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單體結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 化合物11

無(wú)色油狀物，噴灑香草醛-濃硫酸后加熱顯黃色，[α]D-27.3° （c 0.09，CHCl3）。電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）給出分子離子峰[M]+·220，推出化合物的分子量為220 u，碳譜（圖1）給出15個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合DEPT譜，確定其共有3個(gè)甲基，6個(gè)亞甲基，3個(gè)次甲基，3個(gè)季碳（包含一個(gè)羰基 δ 215.8），因此推出分子式為C15H24O，計(jì)算不飽和度為4，為三環(huán)倍半萜類化合物。

圖1 化合物11碳譜圖Fig.1 Carbon-13 spectrum of compound 11

在氫譜中δH0.903、0.939、0.984（each 3H, s）說(shuō)明有3個(gè)甲基均與季碳相連，結(jié)合HSQC譜，表明分別與碳δC26.0（C-13）、21.8（C-14）、30.5（C-15）直接相連。據(jù)此信息點(diǎn)，結(jié)合二維核磁共振譜包括HSQC、COSy、HMBC（圖2）進(jìn)行結(jié)構(gòu)連接和信號(hào)歸屬（表1）。

圖2 關(guān)鍵二維相關(guān)示意圖Fig.2 Key 2D correlations of compound 11

表1 Isocaryolan-9-one核磁數(shù)據(jù)歸屬表（CDCl3,, δ,, J in HHzz）Table 1 NMR Data of isocaryolan-9-one (CDCl3,, δ, JJ inn HHzz）

HMBC譜中，δH0.939（3H, s, H-15）和0.984（3H, s, H-14）均與δC32.9（C-4）、35.9（C-3）、46.3（C-5）遠(yuǎn)程相關(guān)；COSy譜中又可見(jiàn)δH1.34（1H, m, H-6）分別與δH1.62（1H, m, H-5）、2.28（1H, m, H-7）相關(guān)，同時(shí)δH2.28（1H, m, H-7）又與δH2.51（1H, m, H-8）相關(guān)，據(jù)此可連接成結(jié)構(gòu)片段1（圖3）。

圖3 結(jié)構(gòu)片段1Fig.3 Deduced structure of fragment 1

HMBC譜中，δH0.903（3H, s, H-13）與δC31.7（C-1）、42.1（C-2）、36.7（C-11）、42.0（C-12）遠(yuǎn)程相關(guān)，δH2.51（1H, m, H-8）和δH2.45（2H, m, H-10）均與δC215.8（C-9）遠(yuǎn)程相關(guān)；COSy譜中可見(jiàn)δH2.45（2H, m, H-10）與δH1.72（1H, m, H-11）相關(guān)，雖然在碳譜中C-10、C-11均重疊在δC36.7，氫譜和二維COSy可證實(shí)該兩個(gè)亞甲基直接相連；COSy譜中還可見(jiàn)δH2.51（1H, m, H-8）與δH2.28（1H, m, H-7）、2.04（1H, m, H-12）均有相關(guān)，據(jù)此可連接成片段2（圖4）。

圖4 結(jié)構(gòu)片段2Fig.4 Deduced structure of fragment 2

δC44.9（C-8）為兩結(jié)構(gòu)片段所共有，將兩結(jié)構(gòu)片段連接，推出結(jié)構(gòu)為isocaryolane型三環(huán)倍半萜，且羰基在9位，文獻(xiàn)[12]報(bào)道已經(jīng)從番石榴葉中分得石竹烯和氧化石竹烯，從生物合成途徑上，雙環(huán)石竹烷型再環(huán)化成isocaryolane型是可行的。進(jìn)一步分析其NOE譜，可見(jiàn)H-5 （δ 1.62, 1H, m）與H-15（δ 0.939 3H, S），H-12（δ 1.74, 1H, m）有相關(guān)信號(hào)峰，證實(shí)了5位氫與12位亞甲基處于順式的空間定向，綜上確定結(jié)構(gòu)為isocaryolan-9-one（圖5）。經(jīng)檢索，該化合物可通過(guò)氧化石竹烯在四氰基乙烯催化的特殊條件下，發(fā)生氫1,2化學(xué)重排以副產(chǎn)物形成[13]，但在自然界發(fā)現(xiàn)該種極為罕見(jiàn)的天然骨架為首次，因此確定為一新的天然產(chǎn)物。番石榴葉已經(jīng)分離得到了雜萜醛類、二苯甲酮類這些獨(dú)特的新穎骨架[8]，本實(shí)驗(yàn)又獲得了一新穎isocaryolane型倍半萜骨架。

圖5 化合物11結(jié)構(gòu)式Fig.5 Chemical structure of compound 11

2.1.2 化合物1

黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)顯紅色，示其可能為一黃酮類化合物。1H NMR （CD3OD, 600 MHz）δ：6.21（1H, d, J=1.8 Hz, H-6）、6.40（1H, d, J=1.8 Hz, H-8）、7.83（1H, d, J=2.4 Hz, H-2’）、 6.87（1H, d, J=8.4 Hz, H-5’）、7.58（1H, dd, J=2.4, 8.4 Hz, H-6’）、5.15（1H, d, J=7.8 Hz, C-1’’）。13C NMR （CD3OD, 150 MHz）δ：158.9（C-2）、 135.9（C-3）、179.6（C-4）、105.7（C-4a）、163.0（C-5）、99.9（C-6）、166.0（C-7）、94.8（C-8）、158.5（C-8a）、122.9（C-1’）、117.9（C-2’）、145.9（C-3’）、149.9（C-4’）、116.1（C-5’）、123.0（C-6’）、105.5（C-1’’）、73.2（C-2’’）、75.1（C-3’’）、70.0（C-4’’）、77.2（C-5’’）、62.0（C-6’’）。碳?xì)浠瘜W(xué)位移數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[14]報(bào)道的槲皮素3-O-β-D-半乳糖苷比較，完全一致，故鑒定化合物1為金絲桃苷（hyperoside）（圖6），另該文獻(xiàn)中13C核磁數(shù)據(jù)歸屬有部分錯(cuò)誤，本實(shí)驗(yàn)做了校訂。

圖6 化合物1 結(jié)構(gòu)式Fig.6 Chemical structure of compound 1

2.1.3 化合物2

黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)顯紅色，示其可能為一黃酮類化合物。1H NMR（CD3OD, 600 MHz） δ：6.20（1H, s, H-6）、6.39（1H, s, H-8）、7.71（1H, s, H-2’）、6.88（1H, d, J=7.8 Hz, H-5’）、7.58（1H, d, J=7.8 Hz, H-6’）、5.23（1H, d, J=7.2 Hz, C-1’’）。13C NMR（CD3OD, 150 MHz）δ：159.1（C-2）、135.7（C-3）、179.5（C-4）、105.7（C-4a）、163.0（C-5）、99.9（C-6）、166.0（C-7）、94.8（C-8）、158.5（C-8a）、122.1（C-1’）、117.6（C-2’）、145.9（C-3’）、149.9（C-4’）、116.1（C-5’）、123.2（C-6’）、104.4（C-1’’）、75.8（C-2’’）、78.4（C-3’’）、71.3（C-4’’）、78.3（C-5’’）、62.6（C-6’’）。碳?xì)浠瘜W(xué)位移數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[14]比較，完全一致，故鑒定化合物2為槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷，即異槲皮苷（isoquercitrin）（圖7），另該文獻(xiàn)中13C核磁數(shù)據(jù)歸屬有部分錯(cuò)誤，本實(shí)驗(yàn)做了校訂。

圖7 化合物2結(jié)構(gòu)式Fig.7 Chemical structure of compound 2

2.1.4 化合物3

黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)顯紅色，示其可能為一黃酮類化合物。1H NMR （CD3OD, 600 MHz）δ：6.23（1H, d, J=1.8 Hz, H-6）、6.42（1H, d, J=1.8 Hz, H-8）、7.61（1H, d, J=1.8 Hz, H-2’）、6.88（1H, d, J=8.4 Hz, H-5’）、7.58（1H, dd, J=1.8, 8.4 Hz, H-6’）、5.16（1H, d, J=7.2 Hz, C-1’）。13C NMR （CD3OD, 150 MHz）δ：159.1（C-2）、135.4（C-3）、179.4（C-4）、105.7（C-4a）、162.9（C-5）、100.0（C-6）、166.0（C-7）、94.9（C-8）、158.5（C-8a）、123.0（C-1’）、117.3（C-2’）、146.0（C-3’）、149.8（C-4’）、116.2（C-5’）、123.4（C-6’）、104.5（C-1’’）、 75.2（C-2’）、77.4（C-3’’）、71.0（C-4’’）、67.1（C-5''）。與文獻(xiàn)[15]比較，確定化合物3為槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷（quercetin-3-O-β-D- xylpyranoside）（圖8）。

圖8 化合物3結(jié)構(gòu)式Fig.8 Chemical structure of compound 3

2.1.5 化合物4

黃色粉末，HCl-Mg粉反應(yīng)陽(yáng)性，Molish反應(yīng)陽(yáng)性，同時(shí)其紫外-可見(jiàn)吸收光譜明顯可見(jiàn)兩個(gè)黃酮吸收帶（帶Ⅰ：357 nm、帶Ⅱ：258 nm），示其亦為一黃酮苷類化合物。1H NMR（DMSO-d6, 600 MHz）δ：12.6（5-OH）、6.20（1H, d, J=1.8 Hz, H-6）、6.41（1H, d, J=1.8 Hz, H-8）、7.47（1H, d, J=2.4 Hz, H-2’）、6.84（1H, d, J=9.0 Hz, H-5’）、7.55 （1H, dd, J=2.4, 9.0 Hz, H-6’）、5.58（1H, d, J=1.2 Hz, C-1’’）。13C NMR（DMSO-d6, 150 MHz）δ：156.9（C-2）、133.3（C-3）、177.6（C-4）、103.9（C-4a）、161.1（C-5）、98.6（C-6）、164.1（C-7）、93.5（C-8）、156.2（C-8a）、120.9（C-1’）、115.5（C-2’）、145.0（C-3’）、148.4（C-4'）、115.5（C-5’）、121.6（C-6’）、107.8（C-1’）、82.0（C-2’）、76.9（C-3’）、85.8（C-4’）、60.6（C-5’）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故確定化合物4為槲皮素3-O-α-L阿拉伯呋喃糖苷，即廣寄生苷（avicularin）（圖9）。

圖9 化合物4結(jié)構(gòu)式Fig.9 Chemical structure of compound 4

2.1.6 化合物5

黃色針狀結(jié)晶（乙醇），鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性顯紅色。其紫外-可見(jiàn)吸收光譜明顯可見(jiàn)兩個(gè)黃酮吸收帶（帶Ⅰ：360 nm、帶Ⅱ：257 nm），以上提示該化合物為一黃酮類化合物。1H NMR （DMSO-d6, 600 MHz）δ：12.6（5-OH）、6.20（1H, d, J=1.8 Hz, H-6）、6.40（1H, d, J=1.8 Hz, H-8）、7.50 （1H, d, J=2.4 Hz, H-2’）、6.83（1H, d, J=8.4 Hz, H-5’）、7.65 （1H, dd, J=2.4, 8.4 Hz, H-6’）、5.27 （1H, d, J=4.8 Hz, C-1’’）。13C NMR（DMSO-d6, 150 MHz）δ：156.3（C-2）、133.8（C-3）、177.5（C-4）、103.9（C-4a）、161.2（C-5）、98.7（C-6）、164.2（C-7）、93.5（C-8）、156.3（C-8a）、120.9（C-1’）、115.8（C-2’）、144.9（C-3’）、148.6（C-4’）、115.4（C-5’）、122.0（C-6’）、101.4（C-1’）、70.7（C-2’）、71.7（C-3’’）、66.0（C-4’）、64.3（C-5’）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故確定化合物5為番石榴苷（圖10）。

圖10 化合物5結(jié)構(gòu)式Fig.10 Chemical structure of compound 5

2.1.7 化合物6

黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，顯紅色，說(shuō)明可能為一黃酮類化合物。高分辨電噴霧質(zhì)譜（HR-ESI-MS）：m/z 585.079 7 [M-H]-，給出化合物的分子式為C27H22O15。1H-NMR （CD3OD, 600 MHz）δ：6.18（1H, d, J=1.8 Hz, H-6）、6.36（1H, d, J=1.8 Hz, H-8）、7.60 （1H, d, J=1.8 Hz, H-2’）、6.83（1H, d, J=8.4 Hz, H-5’）、7.52 （1H, dd, J=1.8, 8.4 Hz, H-6’）、5.54 （1H, d, J=6.0 Hz, H-1’’）、7.12（2H, s, H-2’’, 6’’）。13C-NMR （CD3OD, 150 MHz）δ：158.2（C-2）、134.8（C-3）、178.9（C-4）、105.5（C-4a）、162.8（C-5）、99.5（C-6）、166.6（C-7）、94.3（C-8）、158.0（C-8a）、122.7（C-1’）、116.8（C-2’）、145.8（C-3’）、149.5 （C-4’）、116.0（C-5’）、123.0（C-6’）、100.6（C-1’’）、73.6（C-2’’）、71.5（C-3’’）、68.6（C-4’’）、65.8（C-5’）、121.1（C-1’’）、110.2（C-2’’, 6’’）、146.1（C-3’’, 5’’）、139.7（C-4’’）、167.4（C-7’’）。依據(jù)光譜分析，與文獻(xiàn)[18]對(duì)照基本一致，確定化合物6為槲皮素-3-O-（2’-O-沒(méi)食子?；?α-L-阿拉伯吡喃糖苷（圖11）。

圖11 化合物6結(jié)構(gòu)式Fig.11 Chemical structure of compound 6

2.1.8 化合物7

黃色晶體（甲醇）與鹽酸鎂粉試劑呈陽(yáng)性反應(yīng)，三氯化鐵反應(yīng)陽(yáng)性顯墨綠色，三氯化鋁反應(yīng)紫外燈照射呈黃綠色熒光，提示該化合物為一黃酮類化合物。1H NMR（DMSO-d6, 600 MHz）δ：6.19（1H, d, J=1.8 Hz, H-6）、6.40（1H, d, J=1.8 Hz, H-8）、7.54（1H, d, J=2.4 Hz, H-2’）、6.87（1H, d, J=8.4 Hz, H-5’）、7.66（1H, dd, J=2.4, 8.4 Hz H-6’）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，并與標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定化合物7為槲皮素（圖12）。

圖12 化合物7結(jié)構(gòu)式Fig.12 Chemical structure of compound 7

2.1.9 化合物8

無(wú)色結(jié)晶（甲醇），薄層展開(kāi)后三氯化鐵顯示陽(yáng)性。1H-NMR（CD3OD, 600 MHz）δ：7.06（2H, s, H-2, 6）、4.26（2H, q, J=7.2 Hz, OCH2CH3）、1.34（3H, t, J= 7.2 Hz, OCH2CH3）。13C-NMR（CD3OD, 150 MHz）δ：168.7（COO-）、146.5（C-3, 5）、139.7（C-4）、121.8（C-1）、110.1（C-2, 6）、61.8（OCH2CH3）、14.6（OCH2CH3）。依據(jù)光譜分析，與文獻(xiàn)[20]數(shù)據(jù)一致，確定化合物8為沒(méi)食子酸乙酯（圖13）。

圖13 化合物8結(jié)構(gòu)式Fig.13 Chemical structure of compound 8

2.1.10 化合物9

無(wú)色針狀結(jié)晶（甲醇），Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽(yáng)性。與齊墩果酸（圖14）對(duì)照品共薄層層析，比移值完全一致。

圖14 化合物9結(jié)構(gòu)式Fig.14 Chemical structure of compound 9

2.1.11 化合物10

圖15 化合物10結(jié)構(gòu)式Fig.15 Chemical structure of compound 10

無(wú)色針狀結(jié)晶（甲醇），易溶于氯仿，可溶于醋酸乙酯、丙酮。Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽(yáng)性。1H-NMR（CDCl3, 600 MHz） δ：5.34（1H, m, H-6）、3.52（1H, m, H-3）、1.00（3H, s, H-19）, 0.91（3H, d, J=6.6 Hz H-21）、0.79～0.86（9H, m, H-26, 27, 29）、0.67（3H, s, H-18）。13C-NMR（CDCl3, 150 MHz） δ：37.2（C-1）、 31.67（C-2）、71.8 （C-3）、42.3（C-4）、140.7（C-5）、121.7（C-6）、31.9（C-7）、31.9（C-8）、50.1（C-9）、36.5（C-10）、21.0（C-11）、39.7（C-12）、42.3（C-13）、56.7（C-14）、24.3（C-15）、28.2（C-16）、56.0（C-17）、 11.9（C-18）、19.4（C-19）、36.1（C-20）、19.0（C-21）、33.9（C-22）、29.1（C-25）、45.8（C-24）、26.0（C-23）、18.7（C-26）、19.8（C-27）、23.0（C-28）、11.8（C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]對(duì)照基本一致，故確定該化合物10為β-谷甾醇（圖15）。同時(shí)對(duì)文獻(xiàn)中碳譜數(shù)據(jù)歸屬錯(cuò)誤重新進(jìn)行了訂正。

2.1.12 化合物12

無(wú)色油狀物，香草醛濃硫酸顯紫紅色。EI-MS給出分子離子峰[M]+·222及[M-H2O]+·碎片離子204。1H-NMR（CDCl3, 600 MHz）δ：0.49（1H, m, H-7）、0.56（1H, m, H-8）、0.93（3H, d, J=7.2 Hz, H-15）、1.02（3H, s, H-13）、1.05（3H, s, H-12）、1.22（3H, s, H-14）。13C-NMR（CDCl3, 150 MHz）δ：55.9（C-1）、26.6（C-2）、34.6（C-3）、35.7（C-4）、37.5（C-5）、28.8（C-6）、27.1（C-7）、19.1（C-8）、42.8（C-9）、72.3（C-10）、20.5（C-11）、15.8（C-12）、28.7（C-13）、31.1（C-14）、16.5（C-15），以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[22]報(bào)道的(-)-epiglobulol（圖16）一致，另外文獻(xiàn)[23]錯(cuò)誤的將(-)-epiglobulol鑒定為viridif l orol。

圖16 化合物12結(jié)構(gòu)式Fig.16 Chemical structure of compound 12

2.1.13 化合物13

無(wú)色油狀物，香草醛濃硫酸顯紫紅色。1H-NMR（CDCl3, 600 MHz）δ：0.81（3H, d, J=7.2 Hz, H-12）、0.93（3H, d, J=7.2 Hz, H-13）、1.23（3H, s, H-14）、1.68（3H, s, H-15）、5.56（1H, m, H-5）。13C-NMR （CDCl3, 150 MHz）δ：48.3（C-1）、22.6（C-2）、30.9（C-3）、134.5（C-4）、123.0（C-5）、37.8（C-6）、46.9（C-7）、19.8（C-8）、40.4（C-9）、71.1（C-10）、26.3（C-11）、15.2（C-12）、21.5（C-13）、28.5（C-14）、23.7（C-15），以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[24]報(bào)道的t-杜松醇（t-cadinol）（圖17）一致。

圖17 化合物13結(jié)構(gòu)式Fig.17 Chemical structure of compound 13

2.1.14 化合物14

無(wú)色油狀物，香草醛濃硫酸顯藍(lán)色。EI-MS給出分子離子峰[M]+·220及[M-H2O]+·碎片離子202。1H-NMR（CDCl3, 600 MHz）δ：0.81（3H, d, J=7.2 Hz, H-12）、0.92（3H, d, J=7.2 Hz, H-13）、1.74（3H, s, H-15）、4.79（1H, m, H-14）、5.13（1H, m, H-14）、5.52（1H, m, H-5）。13C-NMR（CDCl3, 150 MHz）δ：72.9（C-1）、25.5（C-2）、27.0（C-3）、133.6（C-4）、121.8（C-5）、48.4（C-6）、49.8（C-7）、29.8（C-8）、33.1（C-9）、154.2（C-10）、26.9（C-11）、15.2（C-12）、21.7（C-13）、105.8（C-14）、23.7（C-15），以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[25]報(bào)道的muurola-4,10(14)-dien-1-ol（圖18）一致。

圖18 化合物14結(jié)構(gòu)式Fig.18 Chemical structure of compound 14

2.2 活性測(cè)定

2.2.1 葡萄糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線與胰島素降糖效果

圖19 胰島素降糖結(jié)果Fig.19 Hypoglycemic activity of insulin

利用葡萄糖氧化酶法血糖測(cè)定試劑盒和酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.035 5x-0.019 4（R2=0.999 5），式中：x為葡萄糖濃度/（mmol/L），y為吸光度。說(shuō)明通過(guò)比色測(cè)定吸收值，可準(zhǔn)確計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度。對(duì)建立的脂肪細(xì)胞模型，以胰島素為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖19所示，胰島素在10～40 nmol/L范圍內(nèi)能夠劑量依賴性的促進(jìn)脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖，說(shuō)明該模型能夠用于評(píng)價(jià)化合物的促糖吸收活性。

2.2.2 乙酸乙酯萃取物和單體降糖活性

本實(shí)驗(yàn)對(duì)獲得的5個(gè)主要黃酮苷類化合物（化合物1～5）和乙酸乙酯提取物在體外脂肪細(xì)胞模型的促葡萄糖吸收活性進(jìn)行了研究，以對(duì)照組葡萄糖攝取量的基準(zhǔn)值為0，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 乙酸乙酯萃取物和單體降糖活性Table 2 Effects of ethyl acetate extract of guava leaves and its pure compounds on glucose uptake of rat adipocytes

表2 乙酸乙酯萃取物和單體降糖活性Table 2 Effects of ethyl acetate extract of guava leaves and its pure compounds on glucose uptake of rat adipocytes

樣品濃度/（μmol/L）葡萄糖攝取量/（mmol/L）樣品濃度葡萄糖攝取量/（mmol/L）化合物1 10 0.12±0.013化合物4 10 μmol/L1.01±0.044 20 0.23±0.01820 μmol/L1.42±0.037 40 0.54±0.06540 μmol/L1.81±0.029化合物2 10 0.10±0.017化合物5 10 μmol/L0.98±0.054 20 0.42±0.02320 μmol/L1.50±0.023 400.50±0.18540 μmol/L1.74±0.076化合物3 10 0.28±0.022乙酸乙酯萃取物1.2 mg/mL1.75±0.04 20 0.52±0.0290.8 mg/mL0.90±0.26 40 0.79±0.0950.6 mg/mL0.80±0.10

由表2可知，番石榴中5種主要的黃酮苷類均有一定的促脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖能力，均設(shè)定在40 μmol/L條件下比較，5種黃酮苷的降糖活性以番石榴苷、廣寄生苷促糖吸收能力最強(qiáng)，降糖值分別為（1.74±0.076）mmol/L、（1.81±0.029）mmol/L，與1.2 mg/mL乙酸乙酯萃取物降糖能力相當(dāng)，體現(xiàn)了這兩種黃酮苷為主要降糖功能成分；而金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷降糖能力較弱，這同時(shí)也說(shuō)明在這5種單體化合物中，化合物極性較低些，其降糖能力則更強(qiáng)些。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)廣東產(chǎn)番石榴葉粉末進(jìn)行了化學(xué)成分研究，共分得了14種單體化合物：金絲桃苷（1）、異槲皮苷（2）、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷（3）、廣寄生苷（4）、番石榴苷（5）、槲皮素-3-O-(2’’-O-沒(méi)食子酰基）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷（6）、槲皮素（7）、沒(méi)食子酸乙酯（8）、齊墩果酸（9）、β-谷甾醇（10）、isocaryolan-9-one（11）、(-)-epiglobulol（12）、t-cadinol（13）、muurola-4,10(14)-dien-1-ol（14）。其中化合物6、8、11～14為首次從該植物中分得，化合物11為一新的天然產(chǎn)物。從分離化合物類型來(lái)看，番石榴葉乙酸乙酯萃取物主要是以黃酮類和多酚類化合物為主，另外此次共分離得到4種倍半萜類化合物，屬于杜松烷型、香木蘭烷型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)的由石竹烷再環(huán)化形成的新穎天然Isocaryolane型倍半萜在自然界十分罕見(jiàn)，加上雜萜二醛類和二苯甲酮這兩類特有骨架，提示番石榴葉可能為富含多種新穎結(jié)構(gòu)類型的一個(gè)化合物寶庫(kù)。

考慮分離單體化合物得量與溶解性能，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立降糖脂肪細(xì)胞模型，對(duì)番石榴葉5種主要黃酮苷的降糖活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明5種單體均具有一定的促脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖能力，尤其以含量最高的番石榴苷和廣寄生苷的降糖效果最佳，提示可能為番石榴葉的主要降糖功能成分。

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Chemical Constituents from Ethyl Acetate Extract of Psidium guajava Linn. Leaves

OUYANG Wen1, ZHU Xiao-ai2, SHAO Xiang-hui2, LIU Xiao-juan2, LIU Run-nan1, LIU Xin2, DU Fang-lu1, CAO Yong2,*
(1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China）

Objective: To explore the hypoglycemic constituents of ethyl acetate extract of Psidium guajava Linn. leaves. Methods: The constituents were separated and purified by silica gel and Sephadex LH-20 column chromatography. The structures were identified on the basis of their physicochemical properties and spectral data. The hypoglycemic activities of five major flavonoid glycosides were tested in the hypoglycemic model of isolated rat adipocytes. Results: Fourteen compounds were isolated and identified as hyperoside compound (1), isoquercitrin compound (2), quercetin-3-O-β-D-xylpyranoside compound (3), avicularin compound (4), guaijaverin compound (5), quercetin 3-O-α-arabinopyranoside-2’-gallate compound (6), quercetin compound (7), ethyl gallate compound (8), oleanolic acid compound (9), β-sitosterol compound (10), isocaryolan-9-one compound (11), (-)-epiglobulol compound (12), t-cadinol compound (13), and muurola-4,10 (14)-dien-1-ol compound (14), respectively. At the same concentration of 40 μmol/L, avicularin and guaijaverin showed the most potent hypoglycemic activity among five major flavonoid glycosides with the glucose uptake value at (1.81 ± 0.029) and (1.74 ± 0.076) mmol/L respectively. Conclusions: Compounds 6, 8, 11 through 14 were isolated from this plant for the first time and compound 11 was a new natural compound. Avicularin (4) and guaijaverin (5) may be the most potent hypoglycemic compounds of guava leaves.

Psidium guajava Linn.; fl avanoids; sesquiterpenes; isocaryolan-9-one; chemical constituents; hypoglycemic activity

TS201.2

A

1002-6630（2014）15-0030-08

10.7506/spkx1002-6630-201415007

2014-03-05

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201321）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目（13B084）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013J4100075）

歐陽(yáng)文（1981—），男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：oyw810225@126.com

*通信作者：曹庸（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)。E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn