王長(zhǎng)征，周中銀，羅和生

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430060

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病，其臨床特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作與緩解。在世界范圍內(nèi)，每年約有3～20/10萬(wàn)新發(fā)病例［1］。UC對(duì)人類健康影響較大，且為結(jié)腸癌的高危因素。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制，合適的動(dòng)物模型是必不可少的。葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎的動(dòng)物模型與人類UC有許多相關(guān)的表型特征［2］。目前尚無(wú)準(zhǔn)確分析DSS誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的臨床及組織病理學(xué)特點(diǎn)的文獻(xiàn)報(bào)道?；诖耍覀冄芯苛薉SS誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型在不同時(shí)間段的臨床特點(diǎn)和組織病理學(xué)改變。以便于指導(dǎo)我們選擇理想的UC小鼠模型。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物 雄性野生型C57BL/6成年小鼠，體質(zhì)量(25．0±5．0)g，由湖北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予自然光照、(20±3)℃條件。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室配方食物，自由進(jìn)食和飲水。

1．2 動(dòng)物模型構(gòu)建及分組 急性結(jié)腸炎誘導(dǎo)給予口服3%DSS(分子量:54 000，由Sigma公司提供)溶液，DSS水每日更換。取50只小鼠隨機(jī)分為5組，飲用純凈水為D0組;飲用3%DSS溶液共3 d為D3組;飲用3%DSS溶液共5 d為D5組;飲用3%DSS溶液共7 d為D7組;飲用3%DSS溶液共10 d為D10組，每組10只小鼠。

1．3 觀察指標(biāo) 記錄小鼠糞便潛血、血便、體質(zhì)量和小鼠死亡情況。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)的評(píng)定見(jiàn)表1。疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［3］。結(jié)腸組織學(xué)損傷的評(píng)估:每組小鼠飼養(yǎng)到設(shè)定時(shí)間后，乙醚麻醉小鼠，頸椎脫臼法處死，剖腹，取肛門(mén)至回盲部的結(jié)腸，沿腸系膜邊緣縱行剖開(kāi)腸腔，生理鹽水沖洗糞便，在解剖鏡下觀察結(jié)腸大體形態(tài)。每只小鼠取距肛門(mén)相同距離處同一部位組織標(biāo)本(2 mm×10 mm)，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片(4 μm)，蘇木精-伊紅染色，兩位病理學(xué)專家盲法閱片計(jì)分。組織學(xué)損傷程度用炎癥、病變深度、隱窩破壞評(píng)分與病變范圍評(píng)分的乘積表示。小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)文獻(xiàn)［4］。

表1 DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Scoring of DAI in DSS-induced acute colitis in m ice

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 一般情況 DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠第3天開(kāi)始出現(xiàn)稀便、大便潛血陽(yáng)性及明顯體質(zhì)量下降;第5天開(kāi)始出現(xiàn)了血便;第10天開(kāi)始出現(xiàn)死亡小鼠，小鼠死亡率為30%。DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎造模過(guò)程臨床特點(diǎn)見(jiàn)表3。各組小鼠DAI評(píng)分比較見(jiàn)圖1。

2．2 大體形態(tài) DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠黏膜病變從肛門(mén)側(cè)自下向上連續(xù)性發(fā)展，逐漸減輕，直腸最為嚴(yán)重，近端結(jié)腸幾乎正常，病變部黏膜呈中、重度充血水腫，散在糜爛、淺潰瘍。

表2 小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab 2 Histological injury score standard in DSS-induced acute colitis in m ice

表3 DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎造模過(guò)程臨床特點(diǎn)Tab 3 Clinical findings of DSS adm inistration in the acute colitis

圖1 DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型疾病活動(dòng)指數(shù)－時(shí)間變化過(guò)程Fig 1 DAI in the course of DSS-induced acute colitis in m ice

2．3 光鏡下病理形態(tài) 造模前野生型小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)和黏膜都沒(méi)有損害，野生型小鼠結(jié)腸炎造模第3天黏膜上皮細(xì)胞開(kāi)始逐漸喪失，第7～10天最為嚴(yán)重;與此同時(shí)，隱窩結(jié)構(gòu)的紊亂從第3天開(kāi)始發(fā)生，第7天出現(xiàn)固有層塌陷;炎性細(xì)胞浸潤(rùn)從第3天開(kāi)始數(shù)量逐漸增加，第10天最為嚴(yán)重。各組小鼠結(jié)腸組織病理計(jì)分比較見(jiàn)圖2。DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織病理光鏡下改變見(jiàn)圖3。

3 討論

UC的許多研究成果來(lái)源于動(dòng)物體內(nèi)的研究，因而了解UC動(dòng)物模型的臨床特點(diǎn)和結(jié)腸組織病理特征對(duì)UC的研究非常重要［5］。DSS是一種人工合成硫酸多糖體，具有和肝素一樣的抗凝血作用。DSS近年來(lái)常用于誘導(dǎo)UC動(dòng)物模型［6］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3%DSS溶液，給小鼠自由飲用，連續(xù)10 d，出現(xiàn)遠(yuǎn)端結(jié)腸急性炎癥表現(xiàn)。病理及臨床表現(xiàn)與UC相似，說(shuō)明DSS誘導(dǎo)的動(dòng)物模型適合UC的研究。

圖2 DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織病理評(píng)分－時(shí)間變化過(guò)程Fig 2 Histologic score in the course of DSS-induced acute colitis in m ice

圖3 DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織病理改變(HE，100×)Fig 3 Histological analysis of DSS adm inistration in the acute colitis(HE，100×)

DSS溶液5 d后主要表現(xiàn)為腹瀉、血便、體質(zhì)量下降、懶動(dòng)等。光鏡下組織病理學(xué)改變主要為全結(jié)腸多灶性淺潰瘍、隱窩破壞和繼發(fā)黏膜、黏膜下層炎癥，少數(shù)病灶炎癥可侵及漿膜層，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主，伴少量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。這些急性結(jié)腸炎癥改變與文獻(xiàn)報(bào)道的病變相似［7］。

從病理變化過(guò)程發(fā)現(xiàn)，DSS制模后第3天就表現(xiàn)出明顯的腸道損傷，病理改變?cè)诘?天后明顯加重，并且在制模后第7天病理改變到達(dá)高峰，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道是一致的［8］。因此，DSS制模第7天可用于急性炎癥性損傷的研究。從研究中我們注意到，在制模第10天小鼠有一定的死亡率(30%)，而在制模第7天腸道急性損傷的特點(diǎn)已經(jīng)很明顯，沒(méi)有動(dòng)物死亡發(fā)生。分析小鼠制模后一般表現(xiàn)情況，與腸道病理變化過(guò)程是相符的。因此，選擇在制模第7天進(jìn)行急性腸道損傷的研究比較理想。

從已有的文獻(xiàn)報(bào)道［9］和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，3%DSS誘導(dǎo)野生型C57BL/6成年小鼠作為實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)周期短，方法簡(jiǎn)單，制作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，易于復(fù)制，動(dòng)物耐受性好，制模成功率高，是研究UC發(fā)病機(jī)制和藥物治療較理想的工具。

［1］Loftus EV Jr．Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease:incidence，prevalence，and environmental influences［J］．Gastroenterology，2004，126(6):1504-1517．

［2］Clapper ML，Cooper HS，Chang WC．Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia:a promising model for the development of chemopreventive interventions［J］．Acta Pharmacol Sin，2007，28 (9):1450-1459．

［3］Cooper HS，Murthy SN，Shah RS，et al．Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis［J］．Lab Invest，1993，69(2):238-249．

［4］Kullmann F，Arndt H，Gross V，et al．Beneficial effect of ursodeoxycholic acid on mucosal damage in trinitrobenzene sulphonic acid-induced colitis［J］．Eur J Gastroenterol Hepatol，1997，9(12): 1205-1211．

［5］Karlsson A，J?gervall A，Pettersson M，et al．Dextran sulphate sodium induces acute colitis and alters hepatic function in hamsters［J］．Int Immunopharmacol，2008，8(1):20-27．

［6］Sainathan SK，Bishnupuri KS，Aden K，et al．Toll-like receptor-7 ligand Imiquimod induces type I interferon and antimicrobial peptides to ameliorate dextran sodium sulfate-induced acute colitis［J］．Inflamm Bowel Dis，2012，18(5):955-967．

［7］Fischbeck A，Leucht K，F(xiàn)rey-Wagner I，et al．Sphingomyelin induces cathepsin D-mediated apoptosis in intestinal epithelial cells and increases inflammation in DSS colitis［J］．Gut，2011，60(1):55-65．

［8］Melgar S，Karlsson A，Micha?lsson E．Acute colitis induced by dextran sulfate sodium progresses to chronicity in C57BL/6 but not in BALB/c mice:correlation between symptoms and inflammation［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2005，288(6):G1328-G1338．

［9］Wende E，Laudeley R，Bleich A，et al．The complement anaphylatoxin C3a receptor(C3aR)contributes to the inflammatory response in dextran sulfate sodium(DSS)-induced colitis in mice［J］．PLoS One，2013，8(4):e62257．