李會(huì)端，李云興

（楚雄師范學(xué)院,云南楚雄 675000）

酶輔助法提取藕節(jié)中總黃酮及·OH清除活性研究

李會(huì)端，李云興

（楚雄師范學(xué)院,云南楚雄 675000）

優(yōu)選藕節(jié)中總黃酮的提取工藝條件,并研究其對(duì)羥自由基（·OH）的清除活性。采用纖維素酶輔助法提取藕節(jié)中的總黃酮,以70%乙醇固定提取,固定料液比為1∶20 g·m L-1和回流時(shí)間為1 h。設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)初步探究了酶濃度、酶解溫度、酸堿度、酶解時(shí)間4個(gè)單因素條件對(duì)總黃酮提取率的影響,設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)確定了藕節(jié)中總黃酮提取的較佳試驗(yàn)條件。結(jié)果顯示,酶濃度0.20 mg·m L-1,酶解溫度55℃,pH為5.0,酶解時(shí)間2.5 h為藕節(jié)中的總黃酮提取的較佳條件,藕節(jié)中總黃酮提取率為2.680%。探究了藕節(jié)黃酮提取液對(duì)·OH的清除活性,與BHT的抗氧化劑活性對(duì)照,藕節(jié)總黃酮提取液對(duì)·OH有較強(qiáng)的清除活性。

酶輔助法；藕節(jié)；總黃酮；提取率；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)；清除活性

黃酮類化合物泛指2個(gè)苯環(huán)中間通過(guò)3個(gè)碳原子連接形成的一系列化合物。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、消炎、殺菌、抗病毒和調(diào)節(jié)肌體免疫力等功效［1-3］。黃酮類化合物的提取方法有傳統(tǒng)浸提法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法及酶解法［4］。由于植物細(xì)胞壁的束縛作用,使得總黃酮在提取過(guò)程中不易溶出。纖維素酶能降解植物細(xì)胞壁的纖維素骨架,增加細(xì)胞內(nèi)活性成分的溶出,進(jìn)而釋放出黃酮。纖維素酶輔助法提取植物中的總黃酮,具有操作簡(jiǎn)單、提出率高等特點(diǎn)。酶解法提取山楂中總黃酮,提取率高達(dá)（2.67± 0.06）%［5］。蓮藕屬睡蓮科植物,在我國(guó)有悠久的栽培歷史。藕節(jié)為藕的干燥根莖節(jié)部。藕有較高的食用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,但藕節(jié)因不能進(jìn)食往往容易被人們所忽視［6-8］。余美料等［9］采用純物理的工藝流程提取蓮藕中黃酮類物質(zhì),利用紫外線分光光度法測(cè)得樣品中總黃酮的含量為1.13%。作者擬采用纖維素酶酶解法提取藕節(jié)中總黃酮,通過(guò)單因素和正交試驗(yàn),探究藕節(jié)中總黃酮提取工藝的較佳試驗(yàn)條件,旨在為從藕節(jié)中黃酮類化合物的提取和開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

干藕節(jié)（楚雄同濟(jì)堂一中店,產(chǎn)地昆明）粉碎,備用。無(wú)水乙醇；纖維素（＞30 U·mg-1）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、二丁基羥基甲苯、水楊酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、氯化鋁（分析純）；三氯化鐵；鋅粉；亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉等。

722型光柵分光光度計(jì)（山東高密彩虹分析儀器有限公司）,CP214c電子天平,HH-S2s恒溫水浴箱,J1050型托盤(pán)天平,DFY-500 500 g搖擺式高速中藥粉碎機(jī),電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱,回流裝置,蒸餾裝置,容量瓶,吸量管等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮提取率的計(jì)算方法

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照,測(cè)定藕節(jié)中總黃酮的提取率,藕節(jié)總黃酮提取液的顯色反應(yīng)參考文獻(xiàn)［10］。分光光度計(jì)測(cè)量吸光度（D）值,與總黃酮濃度服從Lambert-Beer定律。將藕節(jié)提取液的吸光值代入線性回歸方程,計(jì)算提取液中總黃酮濃度,計(jì)算藕節(jié)中總黃酮提取率。

C0=C×V÷V0,χ/%=100C0÷（2.000× 1 000）×100。

式中,χ藕節(jié)中總黃酮的含量,C為稀釋后濃度,C0為原提取液濃度。

1.2.2 總黃酮提取液對(duì)羥自由基的清除活性

參照Fenton反應(yīng)體系。若向該體系中加入藕節(jié)提取液,與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH,導(dǎo)致有色絡(luò)合物生成量減少。固定反應(yīng)時(shí)間,在510 nm處測(cè)量藕節(jié)提取液的D值,與空白液對(duì)照,測(cè)定藕節(jié)中總黃酮對(duì)·OH的清除率。清除率計(jì)算公式：

·OH的清除率/%=（D0-Dx+Dx0）÷ D0×100。

式中,D0為空白對(duì)照溶液吸光度,Dx為提取液吸光度,Dx0為不加H2O2提取液的本底吸光度。

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確稱取干燥的蘆丁樣品0.010 0 g,用70%乙醇充分溶解,轉(zhuǎn)移至50 m L容量瓶中用同樣濃度的乙醇稀釋定容至刻度,搖勻,備用。移取0.5 m L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于50 m L容量瓶中,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的顯色反應(yīng)參考文獻(xiàn),以試劑空白做參比,在460～540 nm之間測(cè)量D值,確定最大吸收峰波長(zhǎng)。

分別移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00,0.50,1.50,2.50, 3.50,4.50,5.50,6.50 mL于50.00 mL容量瓶中,在最大波長(zhǎng)處測(cè)定D值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 提取液的定性試驗(yàn)

稱取2.000 0 g樣品置于50 m L圓底燒瓶中,加入40 m L 70%乙醇,水浴回流提取1 h。即得總黃酮提取液。

分別移取1.00 m L藕節(jié)總黃酮提取液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于小試管中,第1組試管加入少許鋅粉,再滴加幾滴濃鹽酸,振蕩,必要時(shí)微熱,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。第2組試管滴加幾滴硝酸鋁溶液,振蕩,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。第3組試管滴加幾滴三氯化鐵溶液,振蕩,觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

1.5 單因素試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取2.000 0 g藕節(jié)粉于6支50 m L圓底燒瓶中,單因素處理后,再分別加入28 m L乙醇回流提取1 h,抽濾,洗滌,合并濾液和洗滌液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶,用乙醇定容。

1.5.1 纖維素酶濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

向6支圓底燒瓶中分別加入12 m L纖維素酶濃度為0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mg· m L-1的70%的乙醇,調(diào)節(jié)pH值為5.00,在50℃恒溫水浴中酶解1.5 h。

1.5.2 酶解溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

向6支圓底燒瓶中各加入12 m L纖維素酶濃度為0.15 mg·mL-1的70%的乙醇,調(diào)節(jié)pH值為5.00,分別在40℃,45℃,50℃,55℃,60℃, 65℃恒溫水浴中酶解1.5 h。

式(20)～式(22)中，th的認(rèn)領(lǐng)時(shí)間TExch介于其自身的開(kāi)始時(shí)間TBh與操作oph的開(kāi)始時(shí)間之間，且th的結(jié)束時(shí)間TEh與下一個(gè)任務(wù)節(jié)點(diǎn)th+1的開(kāi)始時(shí)間TBh+1及操作oph的結(jié)束時(shí)間相等，即滿足

1.5.3 酶解pH對(duì)總黃酮提取率的影響

向6支圓底燒瓶中各加入12 m L纖維素酶濃度為0.15 mg·mL-1的70%的乙醇,分別調(diào)節(jié)pH值為3.50,4.00,4.50,5.00,5.50,6.50,在50℃恒溫水浴中酶解1.5 h。

1.5.4 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

向6支圓底燒瓶中各加入12 m L纖維素酶濃度為0.15 mg·m L-1的70%乙醇,調(diào)節(jié)pH值為5.00,在50℃恒溫水浴中分別酶解0.5,1.0, 1.5,2.0,2.5,3.0 h。

1.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)酶濃度（A）、酶解溫度（B）、酶解pH值（C）和酶解時(shí)間（D）等單因素試驗(yàn)所確定的范圍,以藕節(jié)中黃酮含量為研究對(duì)象設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),采用L9（34）的正交表來(lái)確定最優(yōu)方案。1-3水平：A為0.20,0.25和0.30 mg·m L-1；B為50℃,55℃和60℃；C為4.5,5.0和5.5；D為1.5,2.0和2.5 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系方程

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜

2.2 總黃酮提取液定性

表1表明,顯色反應(yīng)現(xiàn)象與黃酮類化合物顯色反應(yīng)現(xiàn)象相同,表明藕節(jié)中含有黃酮類化合物［10］。

表1 藕節(jié)總黃酮提取液的顯色反應(yīng)

2.3 單因素對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.1 酶濃度

圖2表明,隨著纖維素酶濃度增加,總黃酮提取率明顯提高,當(dāng)酶濃度為0.20 mg·m L-1時(shí),黃酮提取率達(dá)到最大,此后增加纖維素酶濃度,總黃酮提取率開(kāi)始下降。試驗(yàn)結(jié)果表明,藕節(jié)總黃酮提取的較佳酶濃度為0.20 mg·m L-1。酶濃度為0.20 mg·m L-1時(shí)酶解效率最大,再增加酶濃度,酶解效率趨于平衡。

圖2 酶濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.2 溫度

圖3表明,在40～55℃,隨著酶解溫度升高總黃酮提取率顯著增加,酶解溫度達(dá)55℃時(shí),總黃酮提取率最大,此后隨著酶解溫度升高,總黃酮提取率迅速降低。分析原因,隨著酶解溫度升高,酶部分失去活性,溫度升高導(dǎo)致先溶出的黃酮類化合物部分分解,總黃酮提取率降低。

圖3 酶解溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.3 pH值圖4表明,隨pH值增大,藕節(jié)總黃酮提取率明顯增加,當(dāng)pH為5.0時(shí),總黃酮提取率最大,繼續(xù)增加pH,總黃酮提取率開(kāi)始降低。分析原因,酶在特定酸堿度下,酶解活性最大,過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)使得酶的活性降低,甚至喪失。藕節(jié)總黃酮提取試驗(yàn)中纖維素酶的最佳活性pH值為5.0。

圖4 酶解pH值對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

圖5表明,隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),總黃酮提取率顯著增加,酶解時(shí)間為2.5 h時(shí),總黃酮提取率最高,再延長(zhǎng)酶解時(shí)間,總黃酮提取率開(kāi)始降低。分析原因?yàn)闀r(shí)間太短,酶解不充分,總黃酮提取不完全；時(shí)間過(guò)長(zhǎng),部分黃酮類化合物會(huì)分解,導(dǎo)致總黃酮提取率降低。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4 多因素對(duì)總黃酮提取率的影響

表2表明,用70%乙醇溶液作提取溶劑,酶濃度0.20 mg·mL-1,酶解溫度55℃,酶解pH值為5.0,酶解時(shí)間為2.0 h,即A1B2C2D2為最佳提取條件。A極差最小,即酶濃度對(duì)藕節(jié)總黃酮提取率影響最??；B極差最大,即酶解溫度對(duì)藕節(jié)總黃酮提取率影響最大。正交試驗(yàn)確定的各因素對(duì)纖維素酶輔助法提取藕節(jié)總黃酮的影響程度依次為B＞D＞C＞A。

按照上述最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn),進(jìn)行3組平行試驗(yàn),纖維素酶輔助法提取藕節(jié)中總黃酮平均提取率為2.68%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 藕節(jié)總黃酮提取液對(duì)·OH清除活性研究

按照1.1.2操作,參考Fenton體系,加入不同體積藕節(jié)提取液,在510 nm處測(cè)D,扣除提取液本底吸收［10］。進(jìn)行3組平行試驗(yàn),代入公式計(jì)算藕節(jié)總黃酮提取液對(duì)·OH清除率。以BHT對(duì)照,比較2種抗氧化劑對(duì)·OH的清除活性（圖6）。藕節(jié)總黃酮提取液對(duì)·OH有清除活性,且隨著提取液體積增加,清除率逐漸增加。試驗(yàn)結(jié)果顯示藕節(jié)總黃酮提取液對(duì)· OH清除活性要高于相同體積的BHT。

圖6 總黃酮提取液和BHT對(duì)·OH清除活性比較

3 小結(jié)和討論

通過(guò)采用纖維素酶輔助法提取藕節(jié)中總黃酮, 70%乙為醇固定提取劑,料液比為1∶20 g·m L-1和回流時(shí)間為1 h,考查纖維素酶濃度、酶解溫度、酶解pH值及酶解時(shí)間4個(gè)單因素對(duì)藕節(jié)總黃酮提取率的影響,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定了藕節(jié)總黃酮提取的較佳條件為：纖維素酶濃度為0.20 mg·m L-1,酶解溫度55℃,pH值為5.0,酶解時(shí)間為2.0 h,測(cè)得藕節(jié)總黃酮提取率為2.68%。較文獻(xiàn)報(bào)道的蓮藕果實(shí)中總黃酮提取率1.30%要高出2倍,可見(jiàn)蓮藕不同部位總黃酮含量差異較大。纖維素酶輔助法提取藕節(jié)總黃酮的方法酶用量少,操作簡(jiǎn)便,提取率高。與70%乙醇回流提取法相比,總黃酮提取率有顯著增加。初步探究了藕節(jié)總黃酮提取液對(duì)·OH清除活性。對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果顯示,藕節(jié)總黃酮提取液對(duì)·OH的清除活性高于相同濃度的BHT。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

TS 201.2

A

0528-9017（2014）03-0383-04

文獻(xiàn)著錄格式：李會(huì)端,李云興.酶輔助法提取藕節(jié)中總黃酮及·OH清除活性研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（3）：383-386.

2013-11-01

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2012FD050）；楚雄師范學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目（11YJGG01）

李會(huì)端（1983-）,女,講師,博士,研究方向?yàn)樘烊皇称坊瘜W(xué)成分分析及應(yīng)用研究。E-mail：lhd08@cxtc.edu.cn。