張凱彥，姜曉文，周校國，于文會

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmo?nary disease，COPD)是多種致病因素引起的小氣道非特異性炎癥反應(yīng)和阻塞性通氣障礙。COPD氣道壁和肺實質(zhì)慢性炎癥及氣道結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致氣道管腔狹窄和氣流阻力增加，這一過程被稱為氣道重塑，氣道重塑可引起細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝紊亂，導(dǎo)致結(jié)締組織的重構(gòu)，是慢性炎癥過程。IL-8和TNF-α炎性介質(zhì)，可破壞肺的結(jié)構(gòu)，或促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)。IFN-γ可通過刺激巨噬細(xì)胞、激活嗜中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及增強(qiáng)TNF-α對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能以及使蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡，從而在COPD氣道炎癥中起作用。TNF-α能促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒并增強(qiáng)其細(xì)胞內(nèi)外蛋白分解作用，而蛋白分解作用的增強(qiáng)被認(rèn)為是慢性阻塞性肺疾病形成機(jī)制之一，因此TNF-α升高促進(jìn)COPD的發(fā)展[6]。另外，氧化與抗氧化失衡也是COPD發(fā)病的重要原因。有文獻(xiàn)報道，白芍提取物和麥冬黃酮提取物有清除體內(nèi)自由基作用[1-2]；平貝母多糖對體內(nèi)自由基有選擇性清除作用[3]；生地黃提取物有一定的抗氧化作用[4]。

本試驗利用止咳平喘方（生地黃10 g，貝母10 g，麥冬10 g，蘆根10 g，白芍10 g，百部10 g，川芎10 g，當(dāng)歸10 g，山藥10 g，五味子10 g，甘草10 g）；煎煮成含量為0.5 g/mL水煎液。與針刺治療COPD模型大鼠，通過臨床觀察和檢測其血清中HA，LN變化、肺組織中TNF-α、IFN-γ、IL-8、GSH、LPO、MDA變化，為動物慢性阻塞性肺疾病治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑 血清中透明質(zhì)酸（HA），層黏連蛋白（LN）含量的測定：用ELISA試劑盒（購自R&D sys?tems公司）；檢測血清中HA，LN含量。脂質(zhì)過氧化物（LPO）測試盒，丙二醛（MDA）測定試劑盒，谷胱甘肽（GSH）（除蛋白）測定試劑盒，丙二醛（MDA）測定試劑盒。

肺組織檢測腫瘤壞死因子α（TNF-α），白細(xì)胞介素8(IL-8)，干擾素γ（INF-γ）的測定，用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-8、INF-γ。脂質(zhì)過氧化物（LPO），谷胱甘肽（GSH），丙二醛（MDA）。

1.1.2 儀器設(shè)備 紫外分光光度計，酶標(biāo)儀，電子顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組與COPD模型制作 Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重(200±20)g，隨機(jī)分為4組，即中藥治療組、針刺治療組、針刺中藥治療組和模型對照組，每組10只。全部大鼠分別于第1、14天氣管內(nèi)注入LPS，劑量為200μg/只。從第2天開始，試驗大鼠放在玻璃缸內(nèi)用煙絲進(jìn)行煙熏，每次0.5 h，每日上午1次[7]。連續(xù)煙熏27 d。

1.2.2 COPD大鼠模型評價 造模結(jié)束后，測定大鼠的呼吸頻率并觀察其臨床表現(xiàn)，每組隨機(jī)抽取1只大鼠，做肺組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.3 COPD治療 COPD模型大鼠，對照組灌服生理鹽水，劑量為10mL/kg·d，連續(xù)4周；針刺治療組取大鼠的肺腧、關(guān)元、合谷、曲池穴位，每次針刺20min/d，同時灌服生理鹽水，劑量為10mL/kg·d，連續(xù)4周；中藥治療組灌服由生地黃，白芍、甘草、蘆根、麥冬、貝母等組成的水煎液，中藥濃度為1 mL/kg。劑量為10mL/kg·d，連續(xù)4周灌服；針刺中藥治療組在灌服止咳平喘方水煎液10mL/kg·d，同時取肺腧、關(guān)元、合谷、曲池針刺，連續(xù)4周。在治療的同時，觀察COPD大鼠的臨床癥狀。

1.2.4 采樣與指標(biāo)檢測 采樣：COPD模型大鼠治療4周后，每只大鼠雙側(cè)眼球采血5 mL，分離血清，并于超低溫冰箱凍存。采血后處死大鼠，取2小塊肺臟組織，一塊置于10%福爾馬林溶液中固定，用于做病理切片；另一小塊置于冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重后，放入小燒杯內(nèi)。然后分步先向小燒杯內(nèi)加冰冷生理鹽水，加入的量為組織塊重量的9倍。首先用移液管取總量的2/3的生理鹽水于燒杯中，剪碎組織后倒入玻璃勻漿管中，再取總量的1/3生理鹽水清洗殘留在燒杯中的碎組織塊，并倒入玻璃勻漿器中進(jìn)行勻漿，制成10%組織勻漿，2 000 r/min離心，取上清液，超低溫冰箱凍存。

血清指標(biāo)檢測：用ELISA試劑盒（購自R&D systems公司），檢測血清中HA，LN含量。

肺組織指標(biāo)檢測：用ELISA試劑盒檢測肺組織勻漿液中TNF-α、IL-8、INF-γ含量。用紫外分光法測試盒檢測肺組織勻漿液中LPO、GSH、MDA含量。

肺組織學(xué)檢測：H.E.染色光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)，并拍照片。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA單因素方差分析和Duncan′s多重比較。

2 試驗結(jié)果

2.1 COPD大鼠模型評價 大鼠經(jīng)氣管灌注脂多糖溶液后，出現(xiàn)咳嗽癥狀；煙熏處理1 d，精神倦怠，3 d后，飲食，飲水減少，喜扎堆抱團(tuán)。模型結(jié)束后出現(xiàn)活動減少，蜷縮，神情呆滯，飲水、采食減少，疲軟毛枯，呼吸短促，伴有咳嗽，流涕，用聽診器聽診能聽到呼吸音，時有噴嚏，體重下降。從肺組織病理學(xué)觀察，可見輕度間質(zhì)性肺炎，肺組織局部間質(zhì)增生。見圖1。

圖1 COPD大鼠肺組織形態(tài)學(xué) （H.E.染色×100）

2.2 治療效果

2.2.1 臨床治療效果 治療兩周后，針刺治療組、中藥治療組及針刺中藥治療組精神尚佳，毛發(fā)較有光澤，飲食正常，呼吸尚平穩(wěn)，體重增重明顯。

2.2.2 各組COPD大鼠血清中透明質(zhì)酸（HA）和層黏連蛋白（LN）變化 中藥治療組與針刺中藥治療組同對照組相比，血清中LN含量均極顯著降低（P＜0.01）；中藥治療組與針刺中藥治療組與針刺治療組相比，血清中LN含量降低（差異極顯著）。針刺治療組、中藥治療組、針刺中藥治療組血清中HA含量較對照組降低（差異極顯著P＜0.01）；針刺中藥治療組血清中HA含量低于針刺治療組，差異極顯著（P＜0.01）。見表1

表1 各組COPD模型大鼠血清中LN與HA含量變化 (ng/mL，n=9，

表1 各組COPD模型大鼠血清中LN與HA含量變化 (ng/mL，n=9，

▲▲：P＜0.01 vs模型對照組；△△：P＜0.01 vs針刺治療組

組別 LN HA模型對照組 18.481±2.994 152.884±29.914針刺治療組 18.859±2.311 114.212±16.649▲▲中藥治療組 6.755±2.417▲▲△△ 101.709±13.7▲▲針刺中藥治療組 7.596±4.522▲▲△△ 90.145±8.784▲▲△△

2.2.3 各組COPD大鼠肺組織GSH、LPO、MDA變化 針刺中藥治療組大鼠肺組織勻漿液中GSH含量較對照組增高，且變化顯著（P＜0.05）；中藥治療組肺組織勻漿液中LPO含量下降較針刺治療組變化顯著；針刺治療組、中藥治療組、針刺中藥治療組肺組織勻漿液中MDA含量均較對照組含量降低，差異極顯著（P＜0.01）；中藥治療組、針刺中藥治療組肺組織勻漿液中MDA含量較針刺治療組含量下降極顯著（P＜0.01）。

2.2.4 中藥針刺對肺組織勻漿液中細(xì)胞因子的影響 中藥治療組肺組織勻漿液中TNF-α含量較對照組下降差異顯著（P＜0.05），較針刺治療組下降極顯著（P＜0.01）；針刺中藥治療組肺組織勻漿液較針刺治療組下降差異顯著（P＜0.05）；針刺治療組、中藥治療組、針刺中藥治療組肺組織勻漿液中INF-γ含量較對照組降低極顯著（P＜0.01）；針刺中藥治療組肺組織勻漿液中INF-γ含量較針刺治療組下降顯著（P＜0.05）；中藥治療組、針刺中藥治療組肺組織勻漿液中IL-8含量較對照組、針刺治療組極顯著下降（P＜0.01）見表3。

表2 各組COPD模型大鼠組織勻漿液GSH、LPO、MDA含量變化 (mg/gprot，n=9，

表2 各組COPD模型大鼠組織勻漿液GSH、LPO、MDA含量變化 (mg/gprot，n=9，

▲：P＜0.05 vs模型對照組；▲▲：P＜0.01 vs模型對照組；△：P＜0.05 vs針刺治療組；△△：P＜0.01 vs針刺治療組，下表同

組別 GSH LPO MDA模型對照組 786.94±258.51 34.2703±12.9880 9.3933±0.6467針刺治療組 835.41±129.60 36.0521±10.1008 6.1188±0.3234▲▲中藥治療組 815.82±89.83 21.0271±3.0157▲ 5.2171±0.4037▲▲△△針刺中藥治療組 1015.72±181.85▲ 26.4983±6.8414 4.9170±0.2744▲▲△△

表3 各組COPD模型大鼠肺組織勻漿液中TNF-α、IFN-γ、IL-8含量的測定 （pg/mL，n=9

表3 各組COPD模型大鼠肺組織勻漿液中TNF-α、IFN-γ、IL-8含量的測定 （pg/mL，n=9

組別 TNF-α IFN-γ IL-8模型對照組 219.594±36.570 247.323±33.327 53.558±11.003針刺治療組 258.855±57.310 116.742±46.406▲▲ 54.574±10.554中藥治療組 110.273±35.963▲△△ 97.195±34.880▲▲ 27.448±13.729▲▲△△針刺中藥治療組 178.426±98.859△ 153.583±44.263▲▲△ 30.315±23.030▲▲△△

2.2.5 中藥針刺對肺組織形態(tài)學(xué)的影響 模型對照組：以肺泡完全閉塞為突出表現(xiàn)，間質(zhì)增生，伴有炎癥，肺泡腔內(nèi)除有出血外，還有大量嗜中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，以及脫落的細(xì)胞。支氣管擴(kuò)張，細(xì)支氣管壁增厚，上皮細(xì)胞脫落，并含有炎性細(xì)胞，有杯狀細(xì)胞增生(圖2，a)。肺血管壁增厚，血管腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤（圖2，b）。有大量的成纖維細(xì)胞增生（圖3，c）。

針刺治療組：可見局部輕度間質(zhì)性炎癥，間質(zhì)增生，間質(zhì)有輕微出血，有少量白細(xì)胞浸潤，有少量巨噬細(xì)胞；支氣管壁輕微增厚，少量杯狀細(xì)胞增生，細(xì)支氣管中有少量滲出物（圖4，d）。間質(zhì)性肺炎，伴有少量出血（圖5）。

中藥治療組：局部肺泡壁出血，間質(zhì)輕微增生，血管壁周圍有炎性浸潤，支氣管壁輕微增厚，或有少量炎性細(xì)胞浸潤，其中含有內(nèi)容物（圖6，e）。局部輕微炎癥變化，支氣管內(nèi)少量杯狀細(xì)胞增生，有少量出血，少量脫落的上皮細(xì)胞（圖7，f）。

針刺中藥治療組：輕度的間質(zhì)性炎癥，血管無明顯變化（圖8，g）。局部輕微間質(zhì)性炎癥，有少量白細(xì)胞浸潤。細(xì)支氣管中有少量內(nèi)容物，未見有管壁增厚（圖9，h）。

圖2 模型對照組1（H.E.染色×100）

圖3 模型對照組2（H.E.染色×200）

圖4 針刺治療組1（H.E.染色×100）

圖5 針刺治療組2（H.E.染色×100）

圖6 中藥治療組1（H.E.染色×100）

圖7 中藥治療組2（H.E.染色×100）

圖8針刺中藥治療組（H.E.染色×100）

圖9 針刺中藥治療組（H.E.染色×100）

3 討論

3.1 COPD模型制作依據(jù)與評價 本試驗COPD模型制作方法是采用在密閉箱內(nèi)點燃煙絲放出的煙霧熏大鼠，使大鼠被動吸煙，同時氣管內(nèi)注入脂多糖溶液，刺激其產(chǎn)生炎癥，并有炎性分泌物滲出阻塞氣道。造模后大鼠出現(xiàn)咳嗽，活動減少，精神倦怠，飲水、采食量減少，喜扎堆抱團(tuán)，出現(xiàn)咳嗽癥狀，流涕，肺聽診有呼吸音，呼吸頻率提高。肺組織切片可以觀察到，局部間質(zhì)增生，說明氣道重塑產(chǎn)生，這與文獻(xiàn)報道相一致[7]。因此，可以認(rèn)定本試驗COPD模型大鼠造模成功。

3.2 不同方法對COPD模型大鼠氣道重塑影響

COPD是以慢性氣道炎癥和氣道重建為主要病理特征，病理變化表現(xiàn)為慢性肺部炎癥和ECM的代謝紊亂而引起的氣道重建。HA是ECM的重要化合物，具有維持水內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)節(jié)血漿蛋白的分布和基質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。HA是一組分子量變化很大的糖胺多糖，正常機(jī)體內(nèi)HA由間質(zhì)細(xì)胞合成，經(jīng)淋巴管入血，大多數(shù)最后由肝臟內(nèi)皮組織攝取并將其分解成乳酸和乙酸；LN是細(xì)胞外間質(zhì)中基底膜的主要成分，本質(zhì)是一種糖蛋白，它廣泛分布于基底膜的透明層，緊貼細(xì)胞基底部，與W型膠原結(jié)合形成基底膜的骨架囚。HA與LN在血清中的水平反映了COPD模型大鼠肺組織損傷程度[9]。從試驗結(jié)果看，除針刺治療組對COPD模型大鼠血清中LN影響無統(tǒng)計學(xué)差異外，中藥治療組與針刺中藥治療組均可降低血清中LN與HA水平，差異極顯著。而針刺治療組中HA也降低，差異極顯著，中藥方與針刺穴位均可影響COPD模型大鼠的氣道重塑，從而起到一定的治療效果。

3.3 不同治療方法對COPD模型大鼠肺組織抗氧化指標(biāo)影響 氧化機(jī)制在COPD的發(fā)生和發(fā)展中起著一定作用，正常情況下，肺自身產(chǎn)生氧化物可以自主清除。而患COPD不但氧化物產(chǎn)生增多，而且清除能力下降。許多研究證據(jù)表明，在吸煙者和COPD患者中出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激增強(qiáng)的現(xiàn)象。氧化應(yīng)激能導(dǎo)致抗蛋白酶的失活，氣腔上皮損傷，黏液的過多分泌，移行進(jìn)入肺部的嗜中性粒細(xì)胞增加，促炎介質(zhì)的基因表達(dá)以及各種轉(zhuǎn)錄因子的活化。氧化應(yīng)激反應(yīng)在機(jī)體對煙草煙霧的炎癥反應(yīng)中可能是非常關(guān)鍵的，其參與了機(jī)體針對煙草煙霧作用的保護(hù)性機(jī)制，主要是誘導(dǎo)的抗氧化劑基因的表達(dá)。GSH和SOD是重要的氧化物清除劑。COPD患者存在著氧化/抗氧化失衡，提高其抗氧化能力有助于患者的康復(fù)[10]。提高機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化酶以減少氧化物的產(chǎn)生或增加非酶性抗氧化劑均為有效措施[11]。有人研究麥冬有促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶和提高氧化酶的表達(dá)作用。白芍既能清除超氧陰離子與羥自由基，還能抑制脂質(zhì)過氧化物.平貝母多糖有抗氧化能力[14-16]。從試驗結(jié)果可知，針刺與中藥方劑止咳平喘方在抗氧化方面都有促進(jìn)作用，且中藥好于針刺治療效果。

3.4 不同治療方法對COPD模型大鼠肺組織中細(xì)胞因子水平的影響 COPD急性期及穩(wěn)定期患者肺泡中IFN-γ含量高于正常水平[12]，IL-8是體內(nèi)重要的內(nèi)源性趨化因子，在COPD中的主要作用是通過趨化、激活嗜中性粒細(xì)胞而實現(xiàn)的。TNF-α的多種前致炎作用可刺激呼吸爆發(fā)，TNF-α的刺激其他細(xì)胞因子分泌作用可提升炎癥級聯(lián)反應(yīng)，IL-8與TNF-α在多個環(huán)節(jié)中的共同作用，使之在肺損傷機(jī)制中更為突出[13]。本試驗結(jié)果顯示，中藥方劑止咳平喘方可以降低相關(guān)細(xì)胞因子的含量，以減少炎癥趨化，從而抑制炎癥反應(yīng)，來緩解COPD的病情發(fā)展。

3.5 不同治療方法對COPD模型大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響 通過針刺及止咳平喘方治療后的COPD模型大鼠，肺組織形態(tài)學(xué)方面有一定的改善，主要表現(xiàn)在間質(zhì)增生、出血及炎癥的緩解，炎性細(xì)胞浸潤的減少，支氣管中脫落物的減少，杯狀細(xì)胞增生的降低。從試驗結(jié)果可得，止咳平喘方以及針刺在一定程度上可以緩解COPD大鼠肺組織形態(tài)學(xué)病變，且中藥與針刺配合使用效果更好。

4 結(jié)論

本試驗利用不同方法對COPD模型大鼠進(jìn)行治療，通過對各種數(shù)據(jù)分析，表明中藥效果好于單純針刺處理的COPD大鼠；中藥方劑與針刺配合使用可以達(dá)到良好的治療效果。

[1] 徐曉燕，吳兆喜，張星，等.不同極性白芍提取物的抗氧化活性研究[J].食品與藥品，2011，13(9)：322-325.

[2] 夏道宗，于新芬，王慧銘，等.麥冬總黃酮提取的響應(yīng)面法優(yōu)化及抗氧化性研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24(12)：1629-1630.

[3] 劉春紅，馬宇，何忠梅，等.平貝母多糖的分離純化及抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2011，32(21)：29-33.

[4] 袁保剛，何全磊，尹丹丹，等.生地黃提取物的抗氧化活性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2011，39(3)：139-145.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.COPD診治指南（2007年修訂版）［J］.繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2007，21(2)：31-42．

[6] 紀(jì)穎，王心杰.血清IL-8、TNF-α在慢性阻塞性肺疾病中的變化及意義[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，18(8)：1249-1250.

[7] 鄭鴻翱.建立慢性阻塞性肺疾病動物模型方法的研究進(jìn)展[J].中國試驗動物學(xué)報，2003，11(4)：249-252.

[9] 高鋒，孔憲濤，王笑利，等.細(xì)胞外間質(zhì)成分與肝病關(guān)系的研究[J].中華內(nèi)科雜志，1994，33(2)：109-112.

[10] 趙小紅，許建英.試驗性吸煙大鼠氧化抗氧化指標(biāo)的研究[J].山西醫(yī)藥雜志，2007，36(10)：884-886.

[11] 鄺土光.慢性阻塞性肺疾病的氧化/抗氧化失衡與抗氧化治療[J].國外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊，2000，20(4)：199-201.

[12] 張念，徐清.吸煙對慢性阻塞性肺疾病患者血清及肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α及干擾素-γ的影響[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28(12)：1980-1982.

[13] 劉景艷，修清正.細(xì)胞因子在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病中的作用[J].國外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊，2005，25(6)：420-422．

[14] 黃麗亞，肖本見.延齡草和麥冬對老化大鼠抗氧化酶表達(dá)作用的比較研究[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報，2006，23(2)：15-17.

[15] 劉方，吳子斌，牛淑敏，等.中藥材抗氧化及自由基清除活性的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2001，36(7)：442-445.

[16] 劉春紅，金鐘斗，韓寶瑞.平貝母多糖對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠的抗氧化作用[J].食品科學(xué)，2011，32(23)：285-288.