羅 飛，劉茵茵(綜述)，符曉華(審校)

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013)

金雀異黃素是一種大豆體內(nèi)天然存在的異黃酮類(lèi)物質(zhì),有抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)和穩(wěn)定其斑塊的作用[1],但它生物利用度差，從而限制了它在治療心血管疾病和腦血管疾病中的應(yīng)用。符曉華[2]以金雀異黃素為先導(dǎo)化合物，在其C-7位選擇性引入二氟亞甲基，同時(shí)5，4′位引入系列烷氧基，設(shè)計(jì)和合成了9個(gè)7-二氟亞甲基-5，4′-取代烷氧基異黃酮(7-difluoromethoxy-5,4′-dimethoxygenistein，DFMG)新化合物。以H2O21.0 mmol處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12細(xì)胞)24 h作為血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷模型，篩選對(duì)血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用的活性新化學(xué)實(shí)體。在篩選中發(fā)現(xiàn)DFMG抗血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷作用效價(jià)強(qiáng)度較其他新化合物強(qiáng)，且為先導(dǎo)物金雀異黃素的100倍。現(xiàn)就DFMG對(duì)As作用機(jī)制的初步研究進(jìn)行歸納。

1 DFMG的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

1.1DFMG抗As的作用機(jī)制 Zhao等[3]通過(guò)As兔模型研究發(fā)現(xiàn)，DFMG對(duì)As的作用主要有：減緩As的發(fā)展；降低血清中的總膽固醇和低密度脂蛋白的水平；減少脂質(zhì)的過(guò)氧化；增加平滑肌細(xì)胞和膠原的數(shù)量，穩(wěn)定As斑塊。游計(jì)良等[4]通過(guò)As兔模型研究發(fā)現(xiàn)，DFMG有較強(qiáng)的抗As的作用，其機(jī)制可能是：高水平的內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)具有促進(jìn)As形成的作用[5]，DFMG可顯著降低As血管中ET-1水平。其可能是通過(guò)抑制ET-1 mRNA表達(dá)來(lái)減少ET-1蛋白的分泌。一氧化氮生成減少可以導(dǎo)致血管張力異常,使血流剪切力改變,從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促使As發(fā)生[6]。DFMG能使血管內(nèi)一氧化氮水平顯著升高，其機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成,導(dǎo)致一氧化氮的產(chǎn)生增多。高同型半胱氨酸可促進(jìn)As的形成[7]，DFMG能降低血管中的同型半胱氨酸。

1.2DFMG穩(wěn)定As斑塊的作用機(jī)制 As斑塊的穩(wěn)定性主要取決于斑塊的內(nèi)部成分，而與斑塊的大小、多少、位置及管腔狹窄程度無(wú)關(guān)[8]。李程等[9]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DFMG作用于家兔As模型可以穩(wěn)定其胸主動(dòng)脈的As斑塊。其機(jī)制可能是通過(guò)影響As斑塊內(nèi)的平滑肌細(xì)胞數(shù)量和膠原的含量而使粥樣斑塊的大小趨于穩(wěn)定。在對(duì)家兔As模型進(jìn)行DFMG干預(yù)的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)DFMG處理的As家兔模型的胸主動(dòng)脈斑塊中膠原含量比模型對(duì)照組、金雀異黃素組和洛伐他汀組顯著增加[9]。其機(jī)制可能是DFMG通過(guò)抗血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)機(jī)制，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)金屬蛋白酶和干擾素γ的形成來(lái)抑制膠原分解促進(jìn)膠原形成，從而穩(wěn)定As斑塊。Zhao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能增加平滑肌細(xì)胞和膠原的數(shù)量，穩(wěn)定As斑塊。由此可見(jiàn)，如何穩(wěn)定As斑塊，從而減少患者發(fā)生更為嚴(yán)重的斑塊破裂、動(dòng)脈瘤、血管栓塞等在臨床上顯得更為重要。

2 DFMG的體外實(shí)驗(yàn)研究

2.1DFMG對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用 Fu等[10]研究表明，DFMG對(duì)血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用。其特點(diǎn)主要有：①DFMG呈濃度依賴(lài)性的降低H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放。②DFMG呈濃度依賴(lài)性的提高H2O2孵育后的內(nèi)皮細(xì)胞成活率。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能拮抗H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。游計(jì)良等[12]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能改善乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴(lài)性舒張功能，對(duì)其進(jìn)行保護(hù)。譚錦盛等[13]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG拮抗溶血性磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡且與其阻斷細(xì)胞活性氧類(lèi)產(chǎn)生及由活性氧類(lèi)激發(fā)的線粒體凋亡途徑有關(guān)。其機(jī)制主要有：DFMG可拮抗LPC上調(diào)細(xì)胞色素C、磷酸化c-Jun氨基端激酶、多腺苷二磷酸核糖聚合酶蛋白等與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)的蛋白的表達(dá)，從而阻斷活性氧類(lèi)促發(fā)的線粒體凋亡途徑。邢小偉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG拮抗LPC誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡且其機(jī)制與阻斷角蛋白18磷酸化表達(dá)有關(guān)。Liu等[15]研究表明，DFMG能有效地保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。其研究發(fā)現(xiàn)，DFMG拮抗溶血性LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用大于三羥異黃酮和維生素E，并發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)，并且都有力地證實(shí)了DFMG對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。Chapman[16]提出血管內(nèi)皮細(xì)胞受損和功能改變是As發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)。Wei等[17]也提出內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡是As發(fā)生早期的重要事件。那么，沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞損傷就難以形成As，也難以進(jìn)一步發(fā)展惡化，因此DFMG可能有預(yù)防As的形成，阻止其進(jìn)一步發(fā)展的作用。

2.2DFMG對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素、細(xì)胞間黏附分子1釋放的影響 王莉等[18]證明DFMG有抑制氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素、細(xì)胞間黏附分子1釋放的作用，從而拮抗氧化誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附的作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2O2可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(diphosphorylated-extracellular signal-regulated kinase1/2，p-ERK1/2)表達(dá)上調(diào),DFMG可下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)。DFMG可能通過(guò)抑制ERK1/2的磷酸化,進(jìn)而抑制氧化誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，DFMG可以有效地抑制氧化應(yīng)激和炎癥誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞之間的黏合，其機(jī)制與核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的下調(diào)密切相關(guān)。Motawi等[19]研究表明，腦血管及心血管As患者中E-選擇素和細(xì)胞間黏附分子1的基因突變的頻率顯著高于對(duì)照組，其有促進(jìn)As形成的趨勢(shì)，抑制E-選擇素、細(xì)胞間黏附分子1釋放有利于拮抗As的發(fā)生、發(fā)展。

2.3DFMG對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α釋放的影響 研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能有效抑制氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子α的釋放[9]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6通過(guò)有絲分裂原活化蛋白激酶和Jun激酶途徑下調(diào)As斑塊的穩(wěn)定性[20]。van der Valk等[21]也提出了拮抗IL-6產(chǎn)生等的As的新型抗炎戰(zhàn)略，其部分藥物已達(dá)臨床開(kāi)發(fā)階段。腫瘤壞死因子α可通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、破壞凝血-抗凝血平衡、促進(jìn)黏附分子產(chǎn)生、促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)等促進(jìn)As發(fā)生[22]。DFMG可能是一種以拮抗IL-6等因子產(chǎn)生的抗As新型活性化學(xué)實(shí)體。

2.4DFMG對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性的影響 Madonna等[23]提出過(guò)量或不適當(dāng)?shù)腘F-κB的激活可導(dǎo)致人發(fā)生炎性疾病，包括As等,而其作為一個(gè)潛在的治療As的新靶點(diǎn)已在臨床上的得到應(yīng)用和重視。王莉等[18]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，H2O2可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB表達(dá)上調(diào)和活性增加，而DFMG可拮抗氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB的表達(dá)上調(diào)和活性的增加以達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的目的。Fu等[10]發(fā)現(xiàn)，DFMG可以下調(diào)NF-κB的表達(dá)。

2.5DFMG與血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體凋亡途徑 研究表明，胱天蛋白酶3(caspase-3)表達(dá)上調(diào)與As發(fā)生有關(guān)[24]。Park等[25]也有類(lèi)似的研究，證明了內(nèi)皮細(xì)胞死亡與caspase-3的活化密切相關(guān)。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能抑制H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3的上調(diào)。李程等[9]研究表明，DFMG可能通過(guò)降低H2O2處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧類(lèi)的產(chǎn)生，阻斷死亡受體和線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下調(diào)的活性。

2.6DFMG對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ERKl/2蛋白和角蛋白18磷酸化的影響 ERKI/2磷酸化增加內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的黏附，而ERK1/2磷酸化受到抑制時(shí)，氧化應(yīng)激損傷得到一定程度逆轉(zhuǎn)[26]。 王莉[18]研究表明，DFMG可下調(diào)氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化ERKl/2的表達(dá)，說(shuō)明DFMG能使內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷得到一定程度的逆轉(zhuǎn)。邢小偉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，LPC可使人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVE-12細(xì)胞)Ser33位和Ser52位磷酸化角蛋白18表達(dá)上調(diào)，而DFMG對(duì)此有拮抗作用。角蛋白18的活化可能通過(guò)調(diào)節(jié)Fas配體相關(guān)的死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物的形成，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[28]。

3 展 望

現(xiàn)有的對(duì)于DFMG抗As作用機(jī)制的初步研究大部分是圍繞其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用開(kāi)展的。早在1993年Ross[29]就發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞異常增殖在As斑塊形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，近年來(lái)對(duì)于血管平滑肌的研究也是熱點(diǎn)。關(guān)于DFMG抗As機(jī)制中是否涉及抑制早期細(xì)胞增殖與遷移和保護(hù)斑塊內(nèi)的平滑肌細(xì)胞是十分必要的。在DFMG的毒理學(xué)方面的研究較少，也是今后必不可少的研究課題。

前期研究已經(jīng)證實(shí)DFMG有較好的抗As的作用，其機(jī)制的初步研究中發(fā)現(xiàn)其作用途徑不完全與經(jīng)典抗As藥物相同，提示DFMG具有強(qiáng)大的潛力，很有可能成為新一代療效顯著的抗As的藥物。但其在臨床的應(yīng)用還有很長(zhǎng)的距離，尚需要進(jìn)行更多的研究來(lái)推動(dòng)DFMG的發(fā)展以及其他抗As藥物研究的發(fā)展。

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