基于囊狀銀鈀鉑合金的無(wú)標(biāo)記型癌胚抗原免疫傳感器的研制

趙錦航，趙錦芝,李能麗,葛艷珊,釧愛(ài)祝,楊光莉,楊云慧

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,云南昆明650092)

0 引言

癌胚抗原（CEA）是1956年Gold 和Freedman首先從胎兒及結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤相關(guān)抗原,為分子量為180-200KD 的多糖蛋白復(fù)合物。主要存在于直腸，結(jié)腸癌組織和胚胎腸粘膜上。這種抗原也存在于2～6個(gè)月胚胎的胃腸、肝臟和胰腺組織中，故名癌胚抗原，也稱(chēng)胚胎抗原(EA)或胎兒抗原（FA），可以在多種液體中檢出[1]。CEA 作為一種最常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)記物，被廣泛用作各種消化系統(tǒng)腫瘤的診斷及檢測(cè)指標(biāo)，CEA 的測(cè)量對(duì)治療效果的觀察同樣有著不可忽略的作用，在臨床中對(duì)于腫瘤疾病的診斷、治療效果的判斷和預(yù)后情況都有非常重要的臨床意義[2～3]。

CEA 的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、放射免疫分析法等，這些方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，但檢測(cè)過(guò)程需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，樣品消耗量也比較大，并且需要昂貴的專(zhuān)用儀器，對(duì)檢測(cè)員的技術(shù)水平要求較高[4]。因此，迫切需要尋找一種價(jià)廉又便捷的免疫測(cè)定方法[5]。電化學(xué)免疫傳感器將免疫分析技術(shù)與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境和食品工業(yè)等方面都有重要應(yīng)用，并以其體積小、專(zhuān)一度強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)快速方便、成本低和容易實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、在線(xiàn)、活體檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一[6]?？乖涂贵w在敏感膜上的結(jié)合和繼后的反應(yīng)引起電流發(fā)生改變，而且這種變化與待測(cè)抗原的濃度之間存在線(xiàn)性關(guān)系，因此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原濃度的檢測(cè)[7]。其中將抗原或抗體，固定到換能器表面稱(chēng)為生物功能物質(zhì)的固定化，固定化技術(shù)是免疫傳感器的研究和開(kāi)發(fā)中最為重要和關(guān)鍵的工作[8]。但由于一般常用固定材料固載抗原或抗體的量較少，從而影響免疫傳感器的靈敏度[9]。因此，開(kāi)發(fā)新型納米材料，研制高靈敏免疫傳感器及建立快速的檢測(cè)癌胚抗原的方法具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值[10]。

該文將中空囊狀銀鈀鉑合金修飾電極表面，用于固定癌胚抗原抗體，構(gòu)建無(wú)標(biāo)記型癌胚抗原免疫傳感器。由于中空結(jié)構(gòu)比普通的納米材料具有更高的比表面積和反應(yīng)活性位點(diǎn)，大大增加導(dǎo)電能力、催化性能、吸附能力[13～14]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

CHI660D 電化學(xué)工作站（中國(guó)上海辰華儀器有限公司），使用三電極體系，其中自制修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極；SK2200HP 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限司）；CS501型超級(jí)恒溫器（中華人民共和國(guó)重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；FA1204B 電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；1KAMS3BASIC混旋儀；HJ-3 恒溫磁力攪拌器。

癌胚抗原定量檢測(cè)試劑盒（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）；人絨毛膜促性腺激素試劑盒（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）；甲胎蛋白測(cè)定診斷試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）。

聚乙烯吡咯烷酮 （K-30）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、殼聚糖、牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)于美國(guó)sigma 公司；鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、尿素購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、乙二醇購(gòu)于成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；HNO3(1 ∶1)購(gòu)于成都化學(xué)試劑廠；AgNO3、PdCl2、乙酰丙酮鉑購(gòu)于昆明鉑銳金屬材料有限公司；醋酸、甘氨酸、丙氨酸購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。試驗(yàn)中所用的以上試劑均為分析純，所用的水均為二次蒸餾水。

1.2 銀鈀鉑合金的合成

取40 mL 乙二醇攪拌加熱至150℃，通N2在三頸燒瓶回流活化1 h，再加90 mg AgNO3,反應(yīng)1 h,再加60 mg PdCl2、130 mg 乙酰丙酮鉑，通N2攪拌反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，產(chǎn)物用乙醇、水各洗三次，最后分散到二次蒸餾水中。

1.3 癌胚抗原免疫傳感器的制備

1.3.1 電極預(yù)處理

將玻碳電極用金相砂紙打磨后，依次再用粒徑為0.3、0.1 和0.05 μm 的Al2O3粉在麂皮上打磨，然后依次用HNO3(1∶1)、無(wú)水乙醇和蒸餾水超聲清洗10 min。將電極取出用蒸餾水沖洗后置于室溫下晾干。

液硫脫氣效果達(dá)標(biāo)后，聯(lián)合裝置硫磺回收單元涉及液硫脫氣的設(shè)備如硫磺冷卻器(E-309)、液硫輸送管線(xiàn)等腐蝕現(xiàn)象大大減緩，腐蝕泄漏事件的發(fā)生率明顯降低，聯(lián)合裝置連續(xù)運(yùn)行周期增長(zhǎng)，為裝置的平穩(wěn)運(yùn)行提供了有效保障[8]。

1.3.2 癌胚抗原免疫傳感器的制備

取4 μL 制備好的銀鈀鉑合金溶液、4 μL 0.5%殼聚糖溶液和4 μL 120 μg/mL 癌胚抗原抗體，混合均勻后，移取10 μL 混合液滴在處理好的玻碳電極表面，過(guò)夜。

用PBS 緩沖液溶液清洗，晾干后取10 μL 1%的BSA溶液滴在電極上在37℃恒溫培育1 h以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后用PBS 緩沖液清洗，制得癌胚抗原免疫傳感器。電極不用時(shí)，置于冰箱中4℃保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)原理及流程

以K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6為氧化還原探針，當(dāng)癌胚抗原與抗體沒(méi)有結(jié)合時(shí)，K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6探針響應(yīng)電流較大，當(dāng)癌胚抗原與抗體結(jié)合時(shí)，覆蓋了銀鈀鉑合金的催化活性位點(diǎn)并增加的電化學(xué)探針的傳質(zhì)阻力，引起K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6探針電流響應(yīng)的減小，通過(guò)測(cè)量培育不同CEA濃度時(shí)電極電流的變化情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CEA含量的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)原理圖見(jiàn)圖1。

圖1 傳感器的制備實(shí)驗(yàn)原理圖Fig.1 Schematic diagram of the immunesensor

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

制備好的癌胚抗原免疫傳感器用PBS 緩沖溶液清洗后，晾干，取10 μL 不同濃度的CEA 滴加在傳感器界面上，于37℃下培育30 min。

該實(shí)驗(yàn)在-0.1～0.5 V 電位范圍內(nèi)采用差示脈沖伏安法(DPV)，在含有5 mmol/L 鐵氰化鉀（0.01 mol/L PBS）的底液中，掃描速度4 mV/s，振幅50 mV,脈沖時(shí)間0.2 s,取樣間隔0.016 7 s，脈沖周期0.5 s。對(duì)癌胚抗原與抗體結(jié)合時(shí)引起K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6探針電流的變化進(jìn)行測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 中空囊狀銀鈀鉑合金納米顆粒的微觀形貌

用高倍透射電鏡觀察了中空囊狀銀鈀鉑合金顆粒的微觀形貌特征。由圖2可知中空囊狀銀鈀鉑合金顆粒的平均粒徑約為100 nm，粒子成中空囊狀，表明成功制備了中空囊狀銀鈀鉑合金納米顆粒。

圖2 中空囊狀銀鈀鉑合金顆粒的TEM 圖Fig.2 TEM image of saccate AgPdPt alloy

2.2 氧化還原峰電流與掃描速度的關(guān)系

改變不同的掃描速度，考查了電極在5 mmol/L 鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安行為，結(jié)果見(jiàn)圖3a (從內(nèi)至外掃描速度分別為20、40、60、80、100、120 mV/s)。從圖3b 中可以看出氧化還原峰電流與掃描速度的平方根成正比，說(shuō)明電流受擴(kuò)散控制。

2.3 銀鈀鉑合金的催化作用

為考察銀鈀鉑合金的催化效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)比較了有無(wú)銀鈀鉑合金時(shí)，傳感器在鐵氰化鉀溶液中的響應(yīng)情況。

圖3 掃描速率對(duì)氧化還原電流的影響Fig.3 The relationship between the redox peak current and scanning rate

圖4為不同修飾電極測(cè)定鐵氰化鉀的DPV曲線(xiàn)，其中a為殼聚糖/銀鈀鉑合金修飾電極對(duì)鐵氰化鉀的響應(yīng)曲線(xiàn)，曲線(xiàn)b為空玻碳電極（GCE）對(duì)鐵氰化鉀的響應(yīng)，從圖中可以看出銀鈀鉑合金納米顆粒對(duì)鐵氰化鉀具有優(yōu)異的催化性能，能夠有效地放大響應(yīng)信號(hào)。

圖4 不同修飾電極在5 mmol/L 鐵氰化鉀底液中的DPV 曲線(xiàn)a為殼聚糖銀鈀鉑合金修飾電極；b為空玻碳電極Fig.4 The DPV voltammograms of different electrodes at potassium ferricyanide solution(5 mmol/L).a.AgPdPt/chit/GCE;b.Bare GCE

2.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.4.1 培育時(shí)間的選擇

抗原-抗體免疫結(jié)合的程度與時(shí)間有關(guān)，考察了37℃條件下抗原培育時(shí)間對(duì)電極響應(yīng)電流的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),培育30 min時(shí),抗原-抗體反應(yīng)已達(dá)平衡(如圖5)，從圖中可以看出30 min 及以后出現(xiàn)近似平臺(tái)。因此選擇30 min 作為培育時(shí)間。

圖5 不同CEA 培育時(shí)間對(duì)電極的影響Fig.5 The effect of incubation time on the response current of immunosensor

2.4.2 固定抗體濃度的優(yōu)化

固定抗體的量對(duì)電極的靈敏度和檢測(cè)范圍有很大影響，因此該文對(duì)抗體濃度進(jìn)行了優(yōu)化。濃度優(yōu)化范圍為12 μg/mL～600 μg/mL。從圖6中可以看出120 μg/mL時(shí)電極的響應(yīng)斜率最大，靈敏度最高。因此實(shí)驗(yàn)選取120 μg/mL 作為固定抗體的濃度。

2.5 癌胚抗原免疫傳感器的響應(yīng)性能

圖7為在最優(yōu)條件下癌胚抗原免疫傳感器在不同濃度的CEA溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在選取的最優(yōu)條件下，氧化峰電流與CEA 濃度在0.5 ng/mL～80 ng/mL 之間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為I(μA)=-0.271 1(log c)+1.778 8,相關(guān)系數(shù)為0.989 0，檢測(cè)下限為0.17 ng/mL。

2.6 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

考察了該電化學(xué)傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。用同一根電極對(duì)同一濃度連續(xù)測(cè)定3次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%，說(shuō)明重現(xiàn)性良好。循環(huán)掃描CV 100 圈以后，還原峰電流達(dá)到初始的94.25%，說(shuō)明穩(wěn)定性良好。

圖6 抗體濃度對(duì)響應(yīng)曲線(xiàn)線(xiàn)性斜率的影響Fig.6 The effect of antibody concentration on the linear slope

圖7 癌胚抗原免疫傳感器的校正曲線(xiàn)Fig.7 The calibration curve of the immunosensor to CEA

2.7 傳感器的選擇性

為了考察傳感器的選擇性，在所選擇的優(yōu)化條件下，在含有40 ng/mL 的CEA溶液中，分別加入了牛血清蛋白、丙氨酸、人絨毛促性腺激素（HCG），共3 種干擾物質(zhì)進(jìn)行干擾試驗(yàn)。測(cè)得的氧化峰電流I干擾+CEA與沒(méi)有干擾物時(shí)測(cè)得的氧化峰電流ICEA的比值見(jiàn)表1，由表1可看出此傳感器具有良好的抗干擾能力。

表1 傳感器的抗干擾測(cè)試Tab.1 Possible interference tested with the immunosensor

2.8 回收率

為了考察傳感器的實(shí)用性，用其測(cè)定了在稀釋的人血清中CEA 的加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。回收率在99.37%～105.45%之間。說(shuō)明該傳感器可用于CEA 的檢測(cè)。

表2 傳感器的回收率Tab.2 The recovery of immunosensor

3 小結(jié)

該實(shí)驗(yàn)利用中空囊狀銀鈀鉑合金修飾電極構(gòu)建一種新型的無(wú)標(biāo)記CEA 免疫傳感器，通過(guò)優(yōu)化條件，提高了CEA 傳感器的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性，使傳感器具有更寬的線(xiàn)性范圍，較低的檢測(cè)下限，為CEA 的檢測(cè)提供了一個(gè)較好的方法。

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