程玉霞 程 丹 關(guān)鵬翔 盧錦麗 武 肖 傅玉穎

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310012）

酵母細(xì)胞是球形或橢球形的單細(xì)胞生物，直徑從幾微米到20μm，安全無(wú)毒［1］，來(lái)源廣泛，生長(zhǎng)繁殖迅速并且易于大規(guī)模培養(yǎng)［2］，具有天然的真核細(xì)胞典型結(jié)構(gòu)，其完整的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有一定的強(qiáng)度和通透性，是理想的微膠囊壁材［3］。酵母細(xì)胞作為微膠囊壁材具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)［4］：在微膠囊制備過(guò)程中不需要或很少添加其他化學(xué)試劑，只需水、酵母細(xì)胞和活性芯物質(zhì)高頻度接觸即可；對(duì)芯物質(zhì)載荷能力可達(dá)70%以上，非常適合藥物和食品添加劑的包覆；具有天然的雙層囊腔結(jié)構(gòu)［5］，可以避免揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)，也可以避免光照、氧氣所引起的氧化變質(zhì)；獲得的微囊產(chǎn)品大小均一、無(wú)毒、生物相容性好、易生物降解。目前，酵母微膠囊化技術(shù)的應(yīng)用范圍包括食品、醫(yī)藥、化妝品、生物型農(nóng)藥、紡織品［4，6］、戒煙產(chǎn)品中封裝尼古?。?］和無(wú)碳復(fù)寫紙等多個(gè)領(lǐng)域。

薄荷油是唇形科植物薄荷的新鮮莖葉經(jīng)蒸餾、冷凍、部分脫脂加工得到的無(wú)色或淡黃色澄清芳香揮發(fā)油［8］，它具有疏風(fēng)散熱、消炎鎮(zhèn)痛、清利頭目、止癢安神等功效，在國(guó)內(nèi)外被廣泛用于食品、保健品、醫(yī)藥、飲料、日用化工等領(lǐng)域［9］。薄荷油極易揮發(fā)，在常溫下為液態(tài)，遇光和熱不穩(wěn)定，在加工中不耐高溫，加工的穩(wěn)定性與貯藏穩(wěn)定性差，嚴(yán)重限制了其發(fā)展應(yīng)用。

為了提高薄荷油在加工與貯存過(guò)程中的穩(wěn)定性能，更好地發(fā)揮薄荷油的功效，本試驗(yàn)采用酵母細(xì)胞將薄荷油微膠囊化，使其從揮發(fā)性強(qiáng)的液態(tài)香料轉(zhuǎn)變成粉末香料，主要運(yùn)用BBD設(shè)計(jì)原理探討研究了酵母微膠囊化薄荷油的工藝，并通過(guò)紅外光譜觀察來(lái)表征薄荷油微膠囊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒干酵母：食品級(jí)，湖北安琪酵母股份有限公司，細(xì)胞內(nèi)脂含量2.0%～2.5%；薄荷油：食品級(jí)，鄭州藍(lán)宇化工有限公司；尼羅藍(lán)A：Nile Blue A，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

D-1-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；78HW-1數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：杭州儀表電機(jī)有限公司；UV-3200PC紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀：美國(guó)Thermo公司；3K30高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 薄荷油微膠囊的制備

按一定芯壁比將薄荷油與活化后的酵母細(xì)胞混合，加水，置于恒溫磁力攪拌器中攪拌一定時(shí)間，離心后傾出，真空抽濾回收未包入油，再用乙醇洗去酵母細(xì)胞表面殘留的薄荷油。真空冷凍干燥24 h，得到薄荷油微膠囊。薄荷油被包埋在酵母細(xì)胞中。

工藝流程：酵母→活化→加入薄荷油和水→攪拌→離心→真空抽濾→清洗→冷凍干燥→微膠囊→包裝→儲(chǔ)存。

1.2.2 薄荷油微膠囊效果的評(píng)定

準(zhǔn)確稱取0.2 g微膠囊后加入20 mL無(wú)水乙醇，在60℃下超聲波浸提80 min后過(guò)濾，采用紫外分光光度法測(cè)定薄荷油濃度。對(duì)薄荷油無(wú)水乙醇溶液，薄荷油微膠囊的乙醇抽取液及干酵母的乙醇抽提液（空白）在200～600 nm進(jìn)行波譜掃描，發(fā)現(xiàn)薄荷油無(wú)水乙醇溶液及微膠囊的乙醇抽取液均在204 nm下有最大吸收峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［3］，而干酵母的乙醇抽提液（空白）在204 nm處沒有明顯的吸收峰。得到薄荷油濃度和吸光度的線性方程y＝1.039 8x-0.008 1，R2＝0.998 8，式中：x為吸光度；y為濃度；R2為相關(guān)系數(shù)。

微膠囊化效果用包埋率來(lái)衡量，計(jì)算公式如下：

包埋率＝酵母微膠囊中薄荷油質(zhì)量／初始薄荷油總質(zhì)量×100%

1.2.3 微膠囊制備工藝的優(yōu)化

在考察了芯壁比、包埋溫度、包埋時(shí)間、加水量等單因素包埋條件的基礎(chǔ)上，以包埋溫度、包埋時(shí)間、加水量3個(gè)因素作為自變量，以薄荷油包埋率為響應(yīng)值，根據(jù)BBD（Box-Behnken design）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Design Expert7.1.3軟件處理數(shù)據(jù)，試驗(yàn)因素及水平。

表1 試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 傅里葉紅外儀觀察

采用溴化鉀壓片法。將酵母細(xì)胞、薄荷油微膠囊以及薄荷油與壁材的物理混合物分別與KBr按2∶200（質(zhì)量）的比例混合、壓片，在傅里葉紅外光譜儀上測(cè)量透光率。壓片時(shí)控制微膠囊和混合物中薄荷油的量一致。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對(duì)薄荷油包埋率的影響

2.1.1 芯壁比的影響

在包埋溫度45℃，包埋時(shí)間5 h，加水量10 mL條件下，研究芯壁比為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1對(duì)薄荷油包埋率的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 芯壁比對(duì)薄荷油包埋率的影響

由圖1可知，芯壁比對(duì)薄荷油包埋率的影響不大。當(dāng)芯壁比小于2∶1時(shí)，薄荷油包埋率隨芯壁比的增大而增大，當(dāng)芯壁比為2∶1時(shí)，薄荷油包埋率達(dá)到最大值，當(dāng)芯壁比大于2∶1時(shí)，薄荷油的包埋率反而隨著芯壁比的增大而略有下降，但變化幅度不是很大。分析原因可能是由于薄荷油通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入酵母細(xì)胞［10］，當(dāng)芯壁比增大時(shí)，進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)薄荷油含量也相應(yīng)增大。綜合考慮選擇芯壁比1∶1。

2.1.2 包埋溫度的影響

在芯壁比為1∶1，包埋時(shí)間為5 h，加水量為10 mL的條件下，研究包埋溫度為 35、40、45、50、55、60℃對(duì)薄荷油包埋率的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2 包埋溫度對(duì)薄荷油包埋率的影響

由圖2可知，包埋溫度對(duì)薄荷油的包埋率影響較大。當(dāng)溫度小于45℃時(shí)，薄荷油的包埋率隨著溫度的升高而不斷增大；當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí)，薄荷油包埋率達(dá)到最大；然而，當(dāng)溫度大于45℃時(shí)，隨著溫度的繼續(xù)升高，薄荷油的包埋率反而不斷減小。分析原因可能是酵母細(xì)胞通過(guò)自由擴(kuò)散包埋薄荷油，溫度升高會(huì)增大酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，加快分子運(yùn)動(dòng)速度，從而促使薄荷油向酵母細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，提高薄荷油包埋率。但溫度過(guò)高會(huì)加快薄荷油的氧化與蒸發(fā)，從而降低薄荷油包埋率。

2.1.3 包埋時(shí)間的影響

在芯壁比為1∶1，包埋溫度為45℃，加水量為10 mL的條件下，研究包埋時(shí)間 3、4、5、6、7 h對(duì)薄荷油包埋率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，包埋時(shí)間對(duì)薄荷油的包埋率影響較大。當(dāng)包埋時(shí)間小于5 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，薄荷油的包埋率不斷增大；當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到5 h時(shí)，薄荷油的包埋率達(dá)到最大，然而隨著包埋時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，薄荷油的包埋率反而不斷下降。分析原因是：時(shí)間的延長(zhǎng)使得通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入酵母細(xì)胞的薄荷油量增大，然而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，薄荷油會(huì)容易蒸發(fā)和氧化，從而降低薄荷油包埋率。

圖3 包埋時(shí)間對(duì)薄荷油包埋率的影響

2.1.4 加水量的影響

在芯壁比為1∶1，包埋溫度為45℃，包埋時(shí)間為5 h的條件下，研究加水量為 5、10、15、20、25、30 mL／g對(duì)薄荷油包埋率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，加水量對(duì)薄荷油的包埋率影響較大。當(dāng)加水量小于15 mL／g時(shí)，隨著加水量的增大，薄荷油的包埋率不斷增大；當(dāng)加水量達(dá)到15 mL／g時(shí)，薄荷油的包埋率達(dá)到最大；然而當(dāng)加水量大于15 mL／g時(shí)，隨著加水量的繼續(xù)增大，薄荷油的包埋率反而不斷減少。分析原因?yàn)椋杭铀渴前襁M(jìn)行的必要介質(zhì)，加水量增加時(shí)會(huì)促進(jìn)薄荷油進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，然而由于薄荷油通過(guò)自由擴(kuò)散的方式進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，加水量過(guò)多會(huì)稀釋薄荷油，導(dǎo)致進(jìn)入酵母細(xì)胞的薄荷油量減少，從而引起薄荷油包埋率下降。

圖4 加水量對(duì)薄荷油包埋率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)Box-Behnken design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，以包埋溫度、包埋時(shí)間、加水量3個(gè)因素作為自變量，以薄荷油包埋率為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design Expert 7.1.3軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到包埋率（Y）與溫度（A）、時(shí)間（B）與時(shí)間（C）的二次回歸方程：

Y＝53．63＋7．77A＋3．13B-8．34C＋2．06AB-0．51AC-4．27BC-8．315A2-20．33B2-6．07C2

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3，各因素及其交互作用對(duì)薄荷油包埋率的影響主次次序?yàn)锽2＞C＞A＞A2＞C2＞B＞BC＞AB＞AC，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響依次為時(shí)間＞溫度＞加水量，建立的二次回歸方程具有極顯著性（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)0.187 8＞0.05，不顯著，說(shuō)明該模型擬合程度好，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)酵母微膠囊化薄荷油工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

圖5～圖7反應(yīng)各因素之間交互作用對(duì)包埋率的影響，可知包埋溫度和包埋時(shí)間、包埋時(shí)間和加水量的交互作用對(duì)包埋率影響顯著，而包埋時(shí)間和加水量的交互作用對(duì)包埋率影響不顯著；3個(gè)因素對(duì)包埋率的影響順序依次為：時(shí)間＞溫度＞加水量，與顯著性分析結(jié)果一致。

圖5 溫度和時(shí)間對(duì)薄荷油包埋率影響的交互作用

圖6 溫度和加水量對(duì)薄荷油包埋率的交互影響

圖7 時(shí)間和加水量對(duì)薄荷油包埋率的交互影響

2.3 最佳工藝條件及驗(yàn)證

由包埋率的回歸方程得到酵母微膠囊化薄荷油的最佳工藝條件：溫度為48.35℃，時(shí)間為6.56 h，加水量為13.15 mL／g，包埋率可達(dá)57.15%。采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)結(jié)合實(shí)際操作情況，將包埋率試驗(yàn)條件調(diào)整為：溫度48℃，時(shí)間6 h，加水量13 mL，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均包埋率為57.33%，與預(yù)測(cè)值十分接近。由此可見，利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酵母微膠囊化薄荷油工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.4 傅里葉紅外光譜試驗(yàn)

對(duì)酵母細(xì)胞、薄荷油微膠囊以及薄荷油與酵母細(xì)胞進(jìn)行紅外掃描，紅外光譜圖見圖8。由圖8可知，酵母細(xì)胞紅外光譜曲線與文獻(xiàn)報(bào)道非常相似［11］。薄荷油微膠囊與酵母細(xì)胞的紅外光譜曲線無(wú)明顯的差異，但與薄荷油和酵母混合物的紅外曲線有明顯差異，由此說(shuō)明薄荷油已包埋在酵母中。

圖8 酵母、微膠囊以及薄荷油與酵母混合物的紅外光譜

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選定包埋溫度、包埋時(shí)間和包埋溫度為目標(biāo)變量，采用BBD響應(yīng)面法，以包埋率為響應(yīng)值指標(biāo)，建立二次項(xiàng)回歸模型：Y＝53.63＋7.77A＋3.13B-8.34C＋2.06AB-0.51AC-4.27BC-8.315A2-20.33B2-6.07C2。所得模型方程（P＜0.01）具有極顯著性，失擬項(xiàng)（P＞0.05）不顯著，說(shuō)明方程擬合程度良好。3個(gè)因素的主次關(guān)系為時(shí)間＞溫度＞加水量。優(yōu)化得到薄荷油的最佳微膠囊化條件為：溫度48℃，時(shí)間6 h，加水量13 mL／g，薄荷油包埋率高達(dá)為57.33%。傅里葉紅外光譜圖中薄荷油微膠囊與酵母壁材的紅外光譜曲線基本相同，表明薄荷油微膠囊薄荷油已被包入酵母壁材內(nèi)。

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