高華娟，李希，黃嫣，馮建安，楊華，李遠(yuǎn)輝

·炮制制劑·

HPLC同時測定抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素含量

高華娟1，李希2，黃嫣2，馮建安2，楊華1，李遠(yuǎn)輝1

目的：建立HPLC同時測定抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素的含量方法。方法：采用Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-水為流動相，線性梯度洗脫，檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL．min-1，柱溫為30℃。結(jié)果：淫羊藿苷、芒柄花素進樣量分別在0.2760-2.760 μg (r=0.9999）和0.1378-1.378 μg (r=0.9999）范圍內(nèi)與峰面積具有良好線性關(guān)系，平均回收率為 98.58% （RSD=1.18%）和 99.32% （RSD=0.41%）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確，可靠，操作簡便，可用于抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素的質(zhì)量控制。

]抗骨增止疼片；高效液相色譜法 ；淫羊藿苷；芒柄花素；含量測定

抗骨增止疼片是由淫羊藿、雞血藤、威靈仙等藥材組成的中藥復(fù)方制劑，本品具有補肝腎，活血，止痛的功效。用于治療骨質(zhì)增生，瘀血阻絡(luò)諸癥，療效顯著。淫羊藿是方中君藥，具補腎壯陽，強筋骨，祛風(fēng)濕等功效；雞血藤為臣藥，補血活血，舒筋活絡(luò)，可治療腰膝酸痛、肢體麻木、風(fēng)濕麻痹等。淫羊藿苷和芒柄花素分別是淫羊藿和雞血藤的主要有效成分[1]。為保證制劑療效，建立簡便、快捷的控制方法，本文參照文獻(xiàn)[2～5]，以淫羊藿苷和芒柄花素為定量控制指標(biāo)，采用HPLC對上述兩種成分同時進行含量測定，結(jié)果顯示方法穩(wěn)定，簡便，可用于本品質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）（美國Agilent公司），DAD檢測器（美國Agilent公司），SZ-93型自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮儀器廠），必能信超聲波清洗器（必能信超聲有限公司），BP2110電子天平（Sartorius公司），TU-1901紫外分光(Sartorius公司)。淫羊藿苷對照品（批號0737-9709，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所提供）、芒柄花素對照品（批號111703-200602，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所提供），乙腈為色譜純（美國Fisher公司出品），水為超純水（自制），甲醇，乙醇，其它試劑均為分析純，抗骨增止疼片（自制）（批號：130301、130302、130303）

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品貯備液制備

精密稱取芒柄花素對照品6.89 mg，置10 mL容量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，用乙醇稀釋至刻度，作為對照品貯備液，得芒柄花素對照品貯備液0.689 mg．mL-1。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取淫羊藿苷6.90 mg，置50 mL容量瓶中,和芒柄花素對照品貯備液5mL，加入乙醇稀釋至刻度，最終得到含淫羊藿苷對照品0.138 mg．mL-1和芒柄花素對照品0.0689 mg．mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備[6]

取同一批次抗骨增止疼片6片，除去薄膜，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入70%乙醇10 mL，超聲處理30 min，放置至室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μL微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性溶液制備

按處方比例稱取除淫羊藿、雞血藤外的其余藥材，依制備工藝制成缺淫羊藿、雞血藤陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。

2.5 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；保護柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm);以乙腈(A)-水(B)為流動相，線性梯度洗脫，0～6min（A：25→30），6～15min（A：30→33）；柱溫30℃；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL．min-1；進樣量：10 μL。淫羊藿苷的理論板數(shù)不低于1500，芒柄花素的理論板數(shù)不低于3000。

2.6 專屬性

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，進樣，陰性對照對樣品無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 抗骨增止痛片HPLC圖

2.7 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，以對照品進樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，分別得淫羊藿苷回歸方程：Y =1172.1X-0.6021，r=0.9999；芒柄花素回歸方程Y =2179.5X-14.394，r=0.9999。結(jié)果表明，淫羊藿苷進樣量在0.2760-2.760 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。芒柄花素進樣量在0.1378-1.378 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.8 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下供試品溶液，連續(xù)進樣5次，結(jié)果淫羊藿苷和芒柄花素峰面積值的RSD分別為0.20%和0.17%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.3”項下供試品溶液，分別于0、2、4、8、24、48 h后注入高效液相色譜儀，結(jié)果淫羊藿苷和芒柄花素峰面積的RSD分別為1.86%和1.31%，結(jié)果表明供試品溶液在48h內(nèi)的穩(wěn)定性良好，能夠滿足含量測定要求。

2.10 重復(fù)性試驗

對同一批樣品（批號130301）分別取樣6份，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按“2.5”的測定方法進行測定。結(jié)果淫羊藿苷和芒柄花素平均含量分別為0.411 mg/g和0.173 mg/g，RSD分別為1.40%和1.27%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.11 再現(xiàn)性實驗

取同一批樣品（批號130301），分別在不同時間由不同的試驗人員按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按“2.5”的測定方法進行測定，結(jié)果淫羊藿苷和芒柄花素平均含量分別為0.418 mg/g和0.174 mg/g，RSD分別為1.41%和1.36%。結(jié)果表明，本含量測定方法的再現(xiàn)性良好。

2.12 準(zhǔn)確度試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號為130301，除去薄膜，研細(xì)）1.5g，分別加入適量淫羊藿苷和芒柄花素，按前述供試品溶液的制備方法及色譜條件進行測定，結(jié)果見表1、表2。

表1 淫羊藿苷回收率試驗結(jié)果

表2 芒柄花素回收率試驗結(jié)果

2.13 樣品含量測定

取3批抗骨增止疼片按前述擬定的含量測定方法進行測定。結(jié)果見表3、表4。

表3 樣品淫羊藿苷含量測定結(jié)果

表4 樣品芒柄花素含量測定結(jié)果

3 討論

用紫外分光光度法，在200-700 nm波長范圍內(nèi)掃描淫羊藿苷和芒柄花素對照品溶液及供試品溶液，結(jié)果淫羊藿苷、芒柄花素的最大吸收波長分別是270 nm和250 nm，但在250 nm處淫羊藿苷和芒柄花素分離效果好，故測定波長確定為250 nm。

在試驗過程中，考察了甲醇超聲提取30 min、70%乙醇超聲提取30 min、70%乙醇回流提取1 h的效果，結(jié)果表明，用甲醇超聲提取后測得淫羊藿苷的含量相較其它2個方法低，芒柄花素含量3個方法相近，因加熱回流的方法費時費力，所以最終選擇70%乙醇超聲提取30 min。

選擇合適的流動相梯度對樣品有效成分分離起著關(guān)鍵的作用，本實驗采用梯度洗脫的方法，可以使淫羊藿苷、芒柄花素和干擾雜質(zhì)進行有效分離，并同時測定這兩個組分的含量，方法簡便可行。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:180,306.

[2] 徐菁,周本宏.用HPLC法測定雞血藤膏中芒柄花素的含量[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2008,21(6):721.

[3] 尹志峰,劉敬閃,張?zhí)m桐.淫羊藿苷的含量測定方法[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2003,23(8):493.

[4] 童玉璽,徐德然.HPLC-MS法分析朝鮮淫羊藿有效部位化學(xué)成分[J].中國天然藥物,2006,1(2):21.

[5] 楊戒驕．柱層析-高效液相色譜法測定乳增寧片中淫羊藿苷含量[J].中國藥房,2004,15(9):565.

[6] 楊加域,譚旭霞.反相高效液相色譜法分析中藥復(fù)方制劑腎寶片中淫羊藿的含量[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報,2006,12(15):99.

（責(zé)任編輯: 胡慧玲）

Simultaneous determination of icariin and formonone in kangguzeng Zhiteng tablets/

GAO Hua-juan1, LI Xi2, HUANGYan, FENG Jian-an, YANG Hua, LI Yuan-hui//(1. Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan; 2. Institute of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To establish a HPLC method for simultaneous determination of icariin and formonone in kangguzeng Zhiteng tablets. Method:The separation was performed on the Shim-pack VP-ODS column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) with acetonitrile-water as the mobile phase. The detection wavelength was at 250 nm, and the fow rate was 1.0 mL．min-1. The column temperature was 30℃. Result:The linear response of icariin ranged from 0.2760 μg to 2.760 μg (r=0.9999). The linear response of formonone ranged from 0.1378 μg to 1.378μg (r=0.9999). The average recovery rates of icariin were 98.58% (RSD=1.18%). The average recovery rates of formonone were 99.32% ,RSD=0.41%. Conclusion:The method is accurate, reliable, simple, and can be used for the quality control of icariin and formonone in kangguzengzhiteng tablets.

kangguzeng Zhiteng tablet; HPLC; icariin; formonone; content determination

R 283.6

A

1674-926X(2014)02-013-03

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川 成都 610031

高華娟（1988-），女，四川彭州人，碩士研究生，主要從事中藥新制劑、新劑型研究

Tel:13082171117 Email:845480633@qq.com

李希（1969-），女，主任中藥師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥新藥、新劑型、新技術(shù)的研究

Tel:028-66449601 Email:syslx2003@aliyun.com

2013-08-05