刁 穎，孫勁旅，湯 蕊，顧建青，李 摯

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，北京100730)

花粉癥屬Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，特應(yīng)性患者因接觸變應(yīng)原花粉而引起過(guò)敏性鼻炎、哮喘等癥狀，其過(guò)敏癥狀的發(fā)作與花粉的播散季節(jié)相吻合，具有明顯的季節(jié)性和地域性。在中國(guó)北方地區(qū)，蒿屬花粉是夏秋季最重要的氣傳花粉之一，這種花粉引起的花粉癥是中國(guó)最常見(jiàn)的過(guò)敏性疾病。目前花粉癥的研究主要集中在流行性調(diào)查、花粉致敏蛋白、食物交叉過(guò)敏和中醫(yī)治療等方面［1-5］，而對(duì)花粉癥患者不同時(shí)期，即花粉季節(jié)的發(fā)作期和非花粉季節(jié)的非發(fā)作期之間的免疫機(jī)制研究不多，特別是兩期患者體內(nèi)免疫細(xì)胞的變化。本研究用自身對(duì)照方式，檢測(cè)2013年8 ～12月北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科門(mén)診診治的花粉癥患者發(fā)作期和非發(fā)作期外周血淋巴細(xì)胞亞群含量，以期進(jìn)一步探討體內(nèi)免疫細(xì)胞在蒿屬過(guò)敏花粉癥患者發(fā)作期和非發(fā)作期的功能狀態(tài)和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2013年8 ～9月份，秋季花粉癥患者癥狀發(fā)作期，在北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科門(mén)診就診的33 例花粉癥患者;非花粉季節(jié)(11 ～12月份)作為非發(fā)作期，對(duì)33 例患者進(jìn)行召回隨訪，其中20 人成功回訪，均無(wú)任何癥狀，也未使用藥物治療，男性11 例，女性9 例，平均年齡為(34.5 ±8.6)歲(25 ～62 歲)。其中14 人為單純過(guò)敏性鼻炎，6 人為過(guò)敏性鼻炎合并哮喘。本次研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有入組對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

入組花粉癥患者均符合以下條件:

1)至少有2年由蒿為主要致敏花粉引起過(guò)敏性鼻炎有/無(wú)季節(jié)性哮喘的病史;2)對(duì)蒿的皮內(nèi)試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)，至少為+ +;3)蒿血清sIgE ＞3 級(jí)，可合并其他花粉過(guò)敏，塵螨、真菌血清sIgE 為0 級(jí);4)采血前至少停用抗組胺藥物3d 和類(lèi)固醇激素1個(gè)月;5)未患有上下呼吸道感染和其他器質(zhì)性疾病。

1.2 主要試劑

溶血素，Multitest 6-color TBNK Kit，單克隆抗體APC-Cy7-CD3、PerCP-CD4、PE-Cy7-CD8、PE-CD28、APC-CD38 及同型對(duì)照抗體(BD 公司)。

1.3 方法

用真空采血管分別抽取花粉癥患者發(fā)作期與非發(fā)作期的EDTA 抗凝靜脈全血4 mL，2 mL 用于外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用全自動(dòng)血液分析儀(XS-800i，上海希森美康醫(yī)用電子有限公司)檢測(cè);2 mL 用于外周血淋巴細(xì)胞亞群分析，采用北京協(xié)和醫(yī)院感染科臨床診斷實(shí)驗(yàn)室流式細(xì)胞儀(FACS CantoⅡ，BD 公司)檢測(cè)。每管加入全血100 μL、CD3、CD4、CD8、CD28 和CD38 單克隆抗體各10 μL 進(jìn)行標(biāo)記，避光孵育15 min，加入500 μL 溶血素，避光溶血15 min，加入2 mL PBS，1 500 r/min，離心5 min，棄上清，重復(fù)1 次，加入750 μL PBS 混勻上機(jī)檢測(cè)，同時(shí)設(shè)同型陰性對(duì)照。T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和NK 細(xì)胞檢測(cè)參照TBNK 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所測(cè)數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。配對(duì)資料要求進(jìn)行正態(tài)性方差齊性檢驗(yàn)，滿(mǎn)足正態(tài)方差齊時(shí)，發(fā)作期與非發(fā)作期比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，不滿(mǎn)足正態(tài)方差齊時(shí)采用配對(duì)Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 花粉癥患者外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

花粉癥患者發(fā)作期與非發(fā)作期外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(表1)顯示，花粉癥發(fā)作期外周血嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞明顯高于非發(fā)作期(P＜0.01)，發(fā)作期嗜酸性細(xì)胞與蒿血清sIgE(39.02 ±36.73)呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

2.2 花粉癥患者外周血淋巴細(xì)胞亞群分析

花粉癥患者發(fā)作期與非發(fā)作期外周血淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果(表2，圖1)顯示，花粉癥患者外周血NK 細(xì)胞計(jì)數(shù)非發(fā)作期高于發(fā)作期(P＜0.05)。CD4+CD28+T 細(xì)胞和CD8+CD28+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)作期高于非發(fā)作期，特別是CD8+CD28+在兩期之間比較有顯著性差異(P＜0.05)。CD8+CD38+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)作期顯著高于非發(fā)作期(P＜0.05)。

表1 花粉癥患者外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 1 The peripheral bloodcounts of thehayfever patients(±s，109/L，n=20)

表1 花粉癥患者外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 1 The peripheral bloodcounts of thehayfever patients(±s，109/L，n=20)

＊P＜0.01 compared with non-onset group．

groupleukocytelymphocytemonocyteneutrop hilbasophileosinophil non-onset6.62 ±1.492.22 ±0.610.44 ±0.173.7 1 ±1.240.03 ±0.020.18 ±0.10 onset7.28 ±1.692.23 ±0.560.43 ±0.124.11 ±1.360.05 ±0.02*0.46 ±0.21*

表2 花粉癥患者外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)Table 2 The lymphocyte subsets counts of peripheral blood in hay fever patients(±s，cells/μL，n=20)

表2 花粉癥患者外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)Table 2 The lymphocyte subsets counts of peripheral blood in hay fever patients(±s，cells/μL，n=20)

*P＜0.05 compared with non-onset group．

groupB cellNK cellCD3 +T CD3 +CD4 +T CD3 +CD8 +T CD4+CD28+T CD8 +CD28 +T CD8 +CD38 +T CD4/CD8 non-onset 298 ±144 282 ±143 1 627 ±464 652 ±269441 ±143629 ±274250 ±91173 ±631.60 ±0.70 onset308 ±118 221 ±114* 1 694 ±470 696 ±253489 ±188671 ±256304 ±136*233 ±95*1.55 ±0.58

圖1 采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)花粉癥患者外周血淋巴細(xì)胞亞群分析Fig 1 Flowcytometric analysis of peripheral blood lymphocyte subsets in hay fever patients

3 討論

花粉癥由患者接觸致敏花粉引起，主要表現(xiàn)為鼻部和/或呼吸道癥狀，以肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞表面IgE 高親和力受體(FcεRI)與IgE 抗體結(jié)合，激活釋放炎性介質(zhì)，引起嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)為特點(diǎn)。嗜酸性細(xì)胞是過(guò)敏性炎性反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，現(xiàn)已知IL5 對(duì)嗜酸性細(xì)胞有分化、聚集和激活作用，阻斷IL5 可明顯降低過(guò)敏患者外周血嗜酸性細(xì)胞含量［6］。嗜堿性細(xì)胞不僅作為過(guò)敏炎性反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞，還有始動(dòng)炎性反應(yīng)和抗原提呈作用［7-8］，并參與IgG 介導(dǎo)的嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)［9］。本研究中花粉癥患者發(fā)作期外周血嗜酸性和嗜堿性細(xì)胞顯著升高，嗜酸性細(xì)胞與sIgE 呈正相關(guān)，提示外周血嗜酸性和嗜堿性細(xì)胞可作為過(guò)敏性疾病輔助指標(biāo)，發(fā)作期外周血嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞濃度升高，可能致使局部病變?nèi)绫丘つさ氖人嵝院褪葔A性細(xì)胞含量增高。

淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能最重要的細(xì)胞群，根據(jù)其生物功能和細(xì)胞表面抗原的表達(dá)可分成3 大類(lèi)，以CD3+為標(biāo)志的T 淋巴細(xì)胞(T 淋巴細(xì)胞分為CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞)、B 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞。CD4+T 細(xì)胞主要為T(mén)h 細(xì)胞亞群，Th1/Th2 失衡與過(guò)敏性炎性反應(yīng)密切相關(guān)［10］。CD8+T細(xì)胞具有免疫抑制和維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的功能。比較分析花粉癥不同發(fā)作時(shí)期CD3+T、CD4+T、CD8+T 淋巴細(xì)胞和CD4/CD8 的表達(dá)，結(jié)果顯示發(fā)作期和非發(fā)作期表達(dá)均處于同一水平，均在正常參考范圍內(nèi)，提示花粉癥雖然是一種與機(jī)體免疫變化相關(guān)的疾病，但與免疫功能密切的淋巴細(xì)胞的變化仍在機(jī)體可調(diào)節(jié)范圍內(nèi)，并不像系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等導(dǎo)致免疫系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的不可逆變化，另一方面由于本研究患者主要為過(guò)敏性鼻炎，可能主要表現(xiàn)在局部鼻黏膜的免疫細(xì)胞改變，而與外周血淋巴細(xì)胞變化無(wú)關(guān)，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞無(wú)顯著變化，但在臨床評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)時(shí)多檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群。NK 細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，通過(guò)分泌不同的細(xì)胞因子參與過(guò)敏炎性反應(yīng)，NK 細(xì)胞現(xiàn)已分為多種亞群，包括與Th1 細(xì)胞相似的NK1 和與Th2 細(xì)胞相似的NK2，NK1 和NK2 細(xì)胞失衡與過(guò)敏性疾病有關(guān)［11］。本研究顯示非發(fā)作期NK 細(xì)胞高于發(fā)作期，可能表明花粉癥患者非發(fā)作期外周血中NK 細(xì)胞多為NK1 亞群。

CD28 分子是T 淋巴細(xì)胞的協(xié)同刺激信號(hào)受體，CD38 是存在于許多免疫細(xì)胞表面的糖蛋白，通過(guò)對(duì)激活信號(hào)的傳導(dǎo)，促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖和激活，可作為細(xì)胞活化標(biāo)志［12-14］。本研究顯示發(fā)作期CD8+CD28+和CD8+CD38+T 細(xì)胞升高，提示發(fā)作期花粉癥患者部分免疫細(xì)胞處于激活狀態(tài)，由此推測(cè)如果抑制發(fā)作期免疫細(xì)胞的激活狀態(tài)，可能會(huì)有效減輕患者的過(guò)敏癥狀，本研究能夠?yàn)檫^(guò)敏性疾病的此類(lèi)治療提供理論基礎(chǔ)。

志謝:感謝北京協(xié)和醫(yī)院感染科李太生主任對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)室邱志峰、謝靜老師在技術(shù)上的支持。

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