徐 海 朱向軍 鄭 群 朱愛平 王傳斌 雷鈞濤

（1江蘇鹽城市第一人民醫(yī)院財(cái)務(wù)科，鹽城 224006；2江蘇鹽城市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，鹽城 224006；3江蘇鹽城市第一人民醫(yī)院科教科，鹽城 224006；4吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)系，吉林 132013）

徐氏腎炎靈膠囊系傳統(tǒng)方劑，含益母草、牡丹皮、山萸肉、當(dāng)歸、紫草、半邊蓮、淮山藥、玉米須、青蒿、牛膝、紅花等藥材，臨床與實(shí)驗(yàn)均表明對(duì)急、慢性腎炎、腎病綜合征有良好的治療作用。筆者研制徐氏腎炎靈膠囊進(jìn)行藥效學(xué)研究，為新藥報(bào)批及其臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物Wi s t a r大鼠90只 （吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）， 體重180～220g。

1.2藥品 徐氏腎炎靈膠囊內(nèi)容藥粉。由鹽城市第一人民醫(yī)院徐海提供，臨用前以蒸餾水配制所需濃度。

1.3試劑 Freund完全佐劑 （美國(guó)西格瑪公司）。肌酐、尿素氮、NO、SOD、MDA檢測(cè)試劑盒 （南京建成公司）。

1.4 Wi s t a r大鼠腎炎模型復(fù)制方法 取wistar大鼠，雌雄各半，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，在無(wú)菌條件下剖開腹腔，結(jié)扎腎動(dòng)脈，自結(jié)扎處向腎臟插管，剪斷腎靜脈，經(jīng)插管用生理鹽水反復(fù)沖洗腎臟，使之成灰白色，取下腎臟，取腎皮質(zhì)用電動(dòng)勻漿器磨成勻漿，每次取皮質(zhì)勻漿10g，加弗氏完全佐劑20mL，緩緩加入生理鹽水40mL置乳缽研勻，使乳化均勻完全。每只實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射上述同種大鼠腎皮質(zhì)加弗氏完全佐劑液，每次2mL/只，每周注射1次，歷時(shí)6周。第五周注射結(jié)束開始給藥。

1.5給藥方案 模型成功大鼠隨機(jī)分為：Wistar腎炎模型組、空白對(duì)照組、徐氏腎炎靈膠囊大、中、小劑量組分別相當(dāng)于含生藥2.7g/mL·100g， 1.35g/mL·100g，0.68g/mL·100g， 地塞米松組 （0.55g/mL·100g）， 每組各10只。正常對(duì)照組和模型組給予同體積蒸餾水，連續(xù)5d， 10d， 15d， 20d。

1.6一般觀察指標(biāo) 分別于給藥不同時(shí)間測(cè)量各組大鼠的尿蛋白、體重、血清及尿中的肌酐和尿素氮，以及血及組織中的SOD和MDA水平，并檢測(cè)毒性相關(guān)生化指標(biāo)，同時(shí)在給藥結(jié)束后對(duì)大鼠腎進(jìn)行切片做病理分析。1.7數(shù)據(jù)處理 測(cè)量數(shù)據(jù)以均數(shù)或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，以P＜0.0 5為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12 4 h尿蛋白定量 分別在給藥處理后5d，10d，15d，20d測(cè)定1次。

表1 24h尿蛋白定量 （×10-2mg）

第34天注射第五針，35天開始給藥，給藥10天、15天時(shí)變化不明顯，20天時(shí)模型組、高劑量組與中低劑量組、對(duì)照組差異明顯。

2.2體重 每隔三天稱體重一次，具體結(jié)果見下表。

表2 各組體重變化比較 （g）

從表中數(shù)據(jù)看出第4天注射第一針，第11天注射第二針，第19天注射第三針，第25天注射第四針，第34天注射第五針，35天開始給藥，40天時(shí)注射佐劑的各組體重下降較明顯而模型組不明顯 (給藥組l5g，模型組2g)，41天注射第六針，48天時(shí)注射佐劑的各組體重下降較明顯 (給藥組10g，模型組27g)。之后各組均持續(xù)增長(zhǎng)到54天，到57天給藥組均停止增長(zhǎng)，模型組增2g，對(duì)照組增10g。地米組體重明顯下降，動(dòng)物狀態(tài)也不好，說(shuō)明激素類藥物對(duì)本模型動(dòng)物影響很大，第50天死一半，第51天全部處死，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟全部病變。說(shuō)明佐劑對(duì)動(dòng)物體重有一定影響。

2.3肌酐

發(fā)布會(huì)上，昆明供電局黨委發(fā)布的《“三個(gè)導(dǎo)向”助推責(zé)任落實(shí)，黨的建設(shè)督導(dǎo)構(gòu)建“昆供模式”》，解決責(zé)任“層層衰減”的案例，是推動(dòng)黨的建設(shè)工作責(zé)任制有效落實(shí)落地，進(jìn)一步構(gòu)建完善大監(jiān)督體系的有力體現(xiàn)。該項(xiàng)目有效地實(shí)現(xiàn)黨的建設(shè)工作重在日常、抓在時(shí)常、嚴(yán)在經(jīng)常，書記項(xiàng)目、黨員突擊隊(duì)等載體成為了黨的建設(shè)融入中心、重點(diǎn)項(xiàng)目攻堅(jiān)、推動(dòng)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的有力抓手，不僅帶動(dòng)了一批黨的建設(shè)業(yè)務(wù)能手，還起到了助推企業(yè)發(fā)展的效果。

表3 各組血清及尿中肌酐水平比較 ）

表3 各組血清及尿中肌酐水平比較 ）

血清（μmol/L）尿（mmol/L）組別 對(duì)照組 模型組 地塞米松組120.84 103.59 96.24中劑量組 低劑量組128.75 113.53±22.66 ±12.38 ±10.83 ±11.54 ±38.52 ±12.85高劑量組107.24 6.98 9.86 7.75 9.43±6.10 ±2.70 ±1.61 ±2.64 8.98±2.96

對(duì)照組與模型組血清肌酐差異顯著 (P≤0.05)說(shuō)明此模型對(duì)血清肌酐有影響；中劑量、低劑量組與對(duì)照組無(wú)差異，說(shuō)明此2組對(duì)改善血清肌酐效果明顯；地米組與對(duì)照組差異顯著 (P≤0.05)，說(shuō)明地米對(duì)改善血清肌酐無(wú)效果。模型組、高劑量組、低劑量組尿肌酐升高明顯，中劑量組升高不明顯。

2.4尿素氮

表4 各組血清及尿中尿素氮水平比較 （，m m o l/L）

表4 各組血清及尿中尿素氮水平比較 （，m m o l/L）

組別 對(duì)照組 模型組 地塞米松組11.59 12.38 9.80血清尿 1561.27 1530.55 1170.55 1537.27±630 ±522 ±287 ±608中劑量組 低劑量組13.02 12.63±1.27 ±2.63 ±1.35 ±2.96 ±2.44 ±1.52高劑量組13.40 1836.25±546

地米組血清尿素氮明顯降低，與各組均差異顯著(P≤0.O5)，說(shuō)明地塞米松對(duì)改善血清尿素氮效果明顯。中劑量組尿尿素氮明顯降低，與模型組差異顯著(P≤0.05)，說(shuō)明中劑量組對(duì)改善尿尿素氮效果明顯。

2.5一氧化氮

表5 各組一氧化氮水平比較 （，μm o l/L）

表5 各組一氧化氮水平比較 （，μm o l/L）

組別 對(duì)照組 模型組 地塞米松組 高劑量組 中劑量組 低劑量組N0 53.72±10.83 79.50±22.40 92.99±29.36 48.32±11.96 55.33±19.38 78.12±23.87

對(duì)照組與模型組差異極顯著 (P≤0.1)說(shuō)明此模型對(duì)N0影響極大；各劑量組與對(duì)照組比差異顯著 (P≤0.05)，高劑量降低，中劑量略有升高，低劑量升高明顯。高、中劑量組與模型組比明顯降低。

2.6S O D

表6 各組血清及尿中SOD水平比較 （，×1 03U/L）

表6 各組血清及尿中SOD水平比較 （，×1 03U/L）

組別 對(duì)照組 模型組 地塞米松組 高劑量組 中劑量組 低劑量組276.83 279.65 281.31 243.73 257.99 249.53血清 ±76.38 ±63.46 ±232.86 ±57.39 ±108.21 ±117.5組織 53.16 107.98 84.16 99.43 115.91 172.40±13.29 ±70.18 ±15.61 ±36.55 ±21.70 ±44.27

模型組、地塞米松組與對(duì)照組比略有增高，而三個(gè)劑量組均略有下降。各組與對(duì)照組比均有增高，中劑量組、低劑量組增高明顯。

2.7MD A

表7 各組血清及尿中MDA水平比較 （，n m o l/m l）

表7 各組血清及尿中MDA水平比較 （，n m o l/m l）

組別 對(duì)照組 模型組 地塞米松組 高劑量組 中劑量組 低劑量組4.84 5.29 7.42 4.83 4.83 4.76±0.89 ±0.47 ±1.79 ±0.50 ±0.65 ±0.86血清組織 0.32 0.44 0.65 0.61 0.64 0.59±0.10 ±0.29 ±0.09 ±0.36 ±0.17 ±0.78

模型組、地塞米松組MDA明顯增高，地塞米松組與各組均差異顯著 (P≤0.05)；各劑量組與對(duì)照組無(wú)差異且略有降低。各組MDA均增高，地塞米松組與各劑量相接近，說(shuō)明脂質(zhì)過氧化增多。

2.8骨組織切片

圖1各組骨組織切片HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示：造模后與對(duì)照組相比，模型組腎小球體積增大，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目增多，近曲小管上皮細(xì)胞腫脹，小管管腔狹小，上皮細(xì)胞中有大量的蛋白樣物質(zhì)沉積，證實(shí)腎臟發(fā)生玻璃樣變性。治療后，低劑量組與模型組比較，腎小球體積略縮小，近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白沉積減少，上皮細(xì)胞玻璃樣變性程度減輕。而中劑量組，腎小球大小與對(duì)照組基本相似，

近曲小管上皮中也未見蛋白沉積，腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)到正常狀態(tài)，證實(shí)中劑量組藥物能夠改善和恢復(fù)腎臟結(jié)構(gòu)。與中劑量組相比，高劑量組腎小管上皮細(xì)胞中有蛋白沉積，但玻璃樣變的程度要輕于模型組。

2.9毒性指標(biāo) 按所能配的最大濃度配制 (相當(dāng)于人的10倍量)，一天給藥3次，后常規(guī)飼養(yǎng)，每三天稱重一次。觀察14天后全部處死，取血清檢測(cè)生化指標(biāo)。

表8 兩組體重變化比較 （g）

第七天體重略比第四天降低外，其他均正常。

表9 兩組生化指標(biāo)檢測(cè)比較

表9 兩組生化指標(biāo)檢測(cè)比較

注：ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶U/L)AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶U/L)GGT(谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶U/L)CRE(肌苷mmol/L)UN(尿素氮mmol/L)UA(尿酸μmol/L)

檢測(cè)指標(biāo) ALT AST 57.95 139.33 UA 90.5±6.75 ±14.59 ±2.89 ±11.61 ±0.48 ±21.50 GGT 1.83 CRE 76.75 UN 7.58藥物組正常組86.33 177.75 2.25 85.00 8.83 92.0±11.49 ±28.88 ±4.5 ±6.22 ±0.67 ±15.90

與正常組比尿酸基本未有變化，肌苷、尿素氮略有降低但未有顯著性差異；ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、GGT(谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)有降低但差異不顯著。

3 討論

Heymann腎炎的臨床過程和病理類型與人類膜性腎病十分接近，作為人類膜性腎病的動(dòng)物模型得到廣泛公認(rèn)，制備該動(dòng)物模型方法有主動(dòng)型Heymann腎炎和被動(dòng)型Heymann腎炎兩種，已經(jīng)證明，Heymann腎炎發(fā)病機(jī)制包括多種細(xì)胞因子、補(bǔ)體激活、膜攻擊復(fù)合物形成、炎癥細(xì)胞以及炎性介質(zhì)合成增加，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎小球基底膜損傷[1]。本研究采用了主動(dòng)型Heymann腎炎模型，觀察徐氏腎炎靈膠囊不同劑量對(duì)模型動(dòng)物的影響，結(jié)果顯示，徐氏腎炎靈膠囊各劑量組均可以降低腎炎大鼠尿素氮和尿蛋白。證實(shí)徐氏腎炎靈膠囊有對(duì)抗Heymann腎炎大鼠的蛋白尿作用。血清肌酐檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與模型組差異顯著 (P≤0.05)說(shuō)明此模型對(duì)血清肌酐有影響；中劑量、低劑量組與對(duì)照組無(wú)差異，說(shuō)明此2組對(duì)改善血清肌酐效果明顯；在Heymann腎炎的機(jī)制探討中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠尿蛋白量增加，各給藥組伴有血清腎皮質(zhì)SOD含量減少，組織SOD含量增多，說(shuō)明Heymann腎炎大鼠尿蛋白形成可能與抗氧化能力有關(guān)。血清、組織MDA含量均增多，說(shuō)明Heymann腎炎大鼠尿蛋白形成可能與脂質(zhì)過氧化增多有關(guān)。模型組炎癥因子NO有明顯的升高，徐氏腎炎靈膠囊各劑量組N0含量與模型組比較有顯著性差異，說(shuō)明徐氏腎炎靈膠囊對(duì)于Heymann腎炎的治療機(jī)制有炎癥因子的表達(dá)參與，但具體影響因素不明。

HE染色結(jié)果顯示：造模后與對(duì)照組相比，模型組腎小球體積增大，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目增多，近曲小管上皮細(xì)胞腫脹，小管管腔狹小，上皮細(xì)胞中有大量的蛋白樣物質(zhì)沉積，證實(shí)腎臟發(fā)生玻璃樣變性。治療后，低劑量組與模型組比較起來(lái)，腎小球體積略縮小，近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白沉積減少，上皮細(xì)胞玻璃樣變性程度減輕。而中劑量組，腎小球大小與對(duì)照組基本相似，近曲小管上皮中也未見蛋白沉積，腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)到正常狀態(tài)，證實(shí)中劑量組藥物能夠改善和恢復(fù)腎臟結(jié)構(gòu)。與中劑量組相比，高劑量組腎小管上皮細(xì)胞中有蛋白沉積，但玻璃樣變的程度要輕于模型組。

綜合以上切片和各種指標(biāo)的觀察，都能看出中劑量藥物組對(duì)本腎炎模型有很好的治療作用，低劑量組略有改變，高劑量組改變不明顯。

毒性試驗(yàn)通過體重、生活狀態(tài)觀察未見異常；生化指標(biāo)檢測(cè)基本正常。

徐氏腎炎靈膠囊中的益母草、半邊蓮、玉米須，有清熱、涼血、利尿、消腫的功效，現(xiàn)代藥理研究證明能起到抑菌、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、減少尿中蛋白的析出[2]；牡丹皮、山萸肉、淮山藥、青蒿有活血、散瘀、補(bǔ)脾胃、益肺腎，能明顯改善血壓、止泄、止久咳之功效；當(dāng)歸、牛膝、紅花有活血、和血、祛瘀、強(qiáng)補(bǔ)肝腎，對(duì)肝腎不足、腰膝酸軟、關(guān)節(jié)酸痛有顯著治療作用，故諸藥合用有清利濕熱、滋陰補(bǔ)腎、益氣活血、消腫止痛等作用[3]。本研究結(jié)果表明，徐氏腎炎靈膠囊組的療效明顯優(yōu)于西藥對(duì)照組，說(shuō)明徐氏腎炎靈膠囊具有對(duì)抗Heymamn腎炎大鼠蛋白尿作用，并有效降低血清肌苷，尿素氮與腎間質(zhì)損傷程度，同時(shí)改善體重，有效控制復(fù)發(fā)。本研究為新藥開發(fā)及其臨床應(yīng)用提供一定藥理學(xué)依據(jù)。

[1]陳灝珠.內(nèi)科學(xué)[M].第4版，北京：人民出版社，2008.

[2]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006.

[3]徐淑云，卞如濂、陳修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006.