孫璐 劉志文 鄒丹 李丹 潘博 叢麗娜

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，大連 116034）

海參溶菌酶枯草芽孢桿菌基因工程菌構(gòu)建

孫璐 劉志文 鄒丹 李丹 潘博 叢麗娜

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，大連 116034）

通過基因重組等技術(shù)構(gòu)建重組海參溶菌酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌，并對此基因工程菌進行生長曲線的測定和穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明，海參溶菌酶基因特異引物在400 bp處擴增出特異性條帶，與預(yù)期的海參溶菌酶基因大小一致；重組表達質(zhì)粒pHT43-SjLys經(jīng)雙酶切驗證得8 000 bp和400 bp左右的片段；重組海參溶菌酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌與原始菌株WB600相比生長趨勢基本一致，外源基因的插入對菌體的生理代謝未造成太大影響；在無選擇壓力的條件下，重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性良好，連續(xù)傳5次后的遺傳穩(wěn)定性為94%，并且提取質(zhì)粒和雙酶切驗證后發(fā)現(xiàn)工程菌沒有發(fā)現(xiàn)重排或丟失現(xiàn)象。表明重組海參溶菌酶基因工程菌pHT43-SjLys/WB600構(gòu)建成功。

基因重組 海參溶菌酶 枯草芽孢桿菌 基因工程菌 表達載體

溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）是一種堿性球蛋白，該酶的作用機理是水解細菌細胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵，進而破壞細胞的肽聚糖致使細胞壁破裂，從而使細菌溶解［1，2］。目前已知的溶菌酶可分為6類：c-型、g-型、i-型、植物溶菌酶、細菌溶菌酶和噬菌體溶菌酶［3，4］。海參溶菌酶屬于i-型溶菌酶。

目前海參溶菌酶還沒有工業(yè)產(chǎn)品，對海參溶菌酶的研究多集中在產(chǎn)酶菌株的篩選、異源高效表達等方面，國內(nèi)已有實驗室成功將海參溶菌酶在大腸桿菌中進行了高效表達［5］。但用大腸桿菌作為宿主時表達產(chǎn)物會有包涵體，分離純化較困難。然而枯草芽孢桿菌為單層膜便于產(chǎn)物分離純化，并且它是一種益生菌［6，7］，自身不產(chǎn)生內(nèi)毒素［8，9］，對人畜無致病性，因此枯草芽孢桿菌是極具潛力的基因工程菌［10-13］。目前已有研究表明側(cè)孢短芽孢桿菌堿性

蛋白酶基因BLG4［14］、甘露聚糖酶基因Man23［15］、耐高溫α-淀粉酶基因［16］等已經(jīng)在枯草芽孢桿菌中得到了高效表達。

本課題組已克隆得到海參溶菌酶基因，為了得到重組海參溶菌酶基因工程菌，本試驗構(gòu)建該基因在枯草芽孢桿菌中的重組表達載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化驗證后，對基因工程菌的生物活性及穩(wěn)定性進行分析，以期獲得較穩(wěn)定的工程菌株，為重組海參溶菌酶基因工程菌的高效表達及實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 質(zhì)粒pHT43和枯草芽孢桿菌WB600購自上海今邁生物有限公司，DH5α和pMD18T-Simple購自于大連寶生物有限公司。

1.1.2 試劑TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SmaⅠ、SolutionⅠ連接液、DNA Marker、氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cam）、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與目的基因SjLys的擴增 根據(jù)海參溶菌酶基因SjLys的cDNA全序列設(shè)計一對引物，上游引物HS-Q-P11：5'-GCCGGATCCATGCAAGTTCCTTCTG-3'，下游引物HS-Q-P12：5'-GCCCGGGAATTCTCAGTTGTTGCTC-3'，下劃線分別為BamH I和SmaI酶切位點。以實驗室保存的pMD18T-SjLys質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次；72℃10 min。擴增完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.2.2 目的基因SjLys的克隆和序列比對 將上述PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切回收后連接到pMD18T-Simple載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)Amp篩選后，提取質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定后，篩選出陽性克隆子，將陽性克隆子pMD18T-Simple-SjLys送至北京華大基因有限公司進行測序，然后進行序列比對分析。

1.2.3 重組表達質(zhì)粒pHT43-SjLys的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 將上述重組克隆質(zhì)粒pMD18T-Simple-SjLys用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切回收目的片段SjLys后，與同樣雙酶切回收后的pHT43用SolutionⅠ連接液進行連接，構(gòu)建了重組表達載體pHT43-SjLys。然后將構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)Amp篩選后，提取質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定后，篩選出陽性克隆子。

1.2.4 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的構(gòu)建及鑒定 將上述構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒pHT43-SjLys通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細胞中［17，18］，在10 μg/mL的Cam的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落做菌落PCR驗證，然后挑取菌落PCR驗證為陽性的轉(zhuǎn)化子于5 mL含有Cam抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒［19］，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切鑒定，篩選陽性克隆子。

1.2.5 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的生長曲線測定 將枯草芽孢桿菌WB600和基因工程菌pHT43-SjLys/WB600分別在LB平板上活化（后者加入10 μg/mL Cam），分別挑取單菌落接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)（后者加入10 μg/mL Cam），然后分別離心收集菌體，再用LB培養(yǎng)基重懸菌體。用紫外分光光度計測定兩菌的OD600值，使兩菌的OD600值相當后按1%接種量分別將兩菌接種于無抗生素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（兩者條件相同），每株菌設(shè)3個重復(fù)試驗，每隔一段時間取樣測定其OD600值。

1.2.6 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的穩(wěn)定性分析 參考蔣嵐［20］的方法挑取重組菌的單菌落，接種至5 mL不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)12 h，再按1%接種量轉(zhuǎn)接到另一個不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再將此菌液稀釋后涂布于無抗生素的LB平板上，然后挑取100個單菌落分別點接在不含抗生素的LB平板上和含Cam的LB平板上，37℃ 培養(yǎng)12 h后計數(shù)平板上的單菌落數(shù)，作為傳1次的質(zhì)粒穩(wěn)定性的標準。如此每隔24 h按1%接種量重新培養(yǎng)，直至計數(shù)傳5次的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 海參溶菌酶基因SjLys序列的獲得

以含海參溶菌酶基因的質(zhì)粒pMD18T-SjLys為模板，特異引物HS-Q-P11和HS-Q-P12擴增出的海參溶菌酶基因SjLys，結(jié)果（圖1）顯示，在400 bp左右處有明顯的條帶，與預(yù)期大小相符，表明擴增成功。

圖1 PCR擴增目的基因SjLys

2.2 重組克隆質(zhì)粒pMD18T-Simple-SjLys的構(gòu)建與鑒定

將上述的溶菌酶基因SjLys進行回收和純化，并將其克隆轉(zhuǎn)化到pMD18T-Simple質(zhì)粒中，獲得重組克隆質(zhì)粒pMD18T-Simple-SjLys，該質(zhì)粒的雙酶切驗證結(jié)果（圖2）顯示，在400 bp和3 000 bp左右處有明顯的特異性條帶，條帶大小與預(yù)期相符。并進一步對其溶菌酶基因SjLys的測序驗證，測序結(jié)果通過Clustal序列比對分析后，結(jié)果表明溶菌酶基因SjLys的重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18T-Simple-SjLys雙酶切驗證

2.3 重組表達質(zhì)粒pHT43-SjLys的構(gòu)建與鑒定

上述的重組質(zhì)粒pMD18T-Simple-SjLys和載體pHT43用BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切后進行連接，構(gòu)建了重組表達載體pHT43-SjLys。重組表達質(zhì)粒pHT43-SjLys，片段長為8 432 bp（圖3）。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600中后提取質(zhì)粒并進行雙酶切驗證，結(jié)果（圖4）顯示，在400 bp左右和8 000 bp左右有明顯的特異性條帶，條帶大小與預(yù)期大小相符，表明重組表達載體的質(zhì)粒已構(gòu)建成功。

2.4 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的生長曲線測定

兩株菌的生長曲線（圖5）顯示，工程菌株和原始菌株的生長趨勢基本一致，枯草芽孢桿菌WB600在接種1.5 h后進入對數(shù)生長期，6 h后對數(shù)生長期結(jié)束，而工程菌株在1 h后進入對數(shù)生長期，比原始菌株提前了0.5 h，對數(shù)生長期在5 h后結(jié)束，比原始菌株提前了1 h，之后兩菌株的生長速度基本保持一致。因此可以看出，外源基因的插入對菌體的生理代謝未造成太大影響。

圖3 重組表達載體pHT43-SjLys圖譜

圖4 重組載體pHT43-SjLys雙酶切驗證

圖5 枯草芽孢桿菌WB600和基因工程菌pHT43-SjLys/ WB600的生長曲線

2.5 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的穩(wěn)定性分析

對于工程菌株穩(wěn)定性的分析是將工程菌株pHT43-SjLys/WB600在沒有抗生素的LB培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，每傳1次取菌液進行測定，結(jié)果（圖6）顯示，在無選擇壓力的條件下，重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性良好，連續(xù)傳5次后的遺傳穩(wěn)定性為94%。然后分別提取連續(xù)傳3次和5次的工程菌pHT43-SjLys/WB600的質(zhì)粒并進行雙酶切檢測，得出傳3次和5次的菌，在含Cam的培養(yǎng)基上沒有生長的菌提取不到質(zhì)粒，而依然在Cam抗性平板上生長的細菌可以提取到質(zhì)粒并且質(zhì)粒大小與出發(fā)菌株大小一致，而且酶切結(jié)果也相同，因此說明工程菌沒有發(fā)生重排或丟失現(xiàn)象。

圖6 工程菌pHT43-SjLys/WB600穩(wěn)定性分析

3 討論

海參溶菌酶存在于海刺參的各個組織中，由于海洋高鹽、高壓、低溫等獨特的地理環(huán)境使得該酶具有了其它陸地生物來源的溶菌酶所不具備的特點，所以，這類溶菌酶的研究也越來越廣泛［21，22］。傳統(tǒng)方法生產(chǎn)溶菌酶具有成本高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜等問題，所以應(yīng)用生物工程的方法生產(chǎn)溶菌酶基因工程菌已成為了當今的發(fā)展趨勢。目前對海參溶菌酶的研究多是構(gòu)建海參溶菌酶大腸桿菌基因工程菌［23］，但大腸桿菌作為表達菌株會產(chǎn)生包涵體，分離純化比較困難，生產(chǎn)成本較高等問題，這也是目前該酶在工業(yè)上難以推廣的原因?？莶菅挎邨U菌是一種益生菌，對人體無致病性，有較強的胞外分泌能力，且外源蛋白不會經(jīng)過大腸桿菌包涵體復(fù)性，因此簡化了外源蛋白的分離純化。

本研究采用枯草芽孢桿菌作為表達宿主，為海參溶菌酶的高效表達提供了一個新的途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌會分泌至少7種不同的胞外蛋白酶，這些蛋白酶沒有底物的專一性，會將外源蛋白進行降解［24］，但有研究表明，可以通過使枯草芽孢桿菌自身的蛋白酶基本失活的方法來減少蛋白酶對外源蛋白的降解，進而提高外源蛋白得率［25］。所以本研究選取了缺失6種胞外蛋白酶的枯草芽孢桿菌WB600［26］作為表達宿主，大大減少了胞外蛋白酶對外源蛋白降解的問題。由于重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌后可能會影響其生長規(guī)律，而生長曲線可以較好地反應(yīng)出菌株的生長情況，因此本研究對重組菌株與原始菌株進行了生長曲線的測定，試驗結(jié)果表明重組質(zhì)粒的導(dǎo)入對菌體的生理代謝未造成太大影響。在枯草芽孢桿菌的表達質(zhì)粒中，Bron等［27］研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的可復(fù)制質(zhì)粒進行復(fù)制時會產(chǎn)生單鏈DNA，容易導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失，但這個問題可以通過引入θ-復(fù)制模式質(zhì)?？朔员狙芯窟x用了具有θ-復(fù)制模式的pHT43表達載體，減少了質(zhì)粒丟失的問題。并且本研究進一步通過對工程菌株穩(wěn)定性的測定來驗證重組質(zhì)粒的丟失情況，試驗結(jié)果表明，本試驗構(gòu)建的基因工程菌沒有出現(xiàn)重排或丟失的現(xiàn)象。綜上所述，重組海參溶菌酶基因工程菌成功的構(gòu)建，為近一步研究海參溶菌酶的高效表達奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功將海參溶菌酶基因SjLys克隆到了pHT43表達載體上，構(gòu)建了pHT43-SjLys重組表達載體，并轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB600中，成功構(gòu)建了重組海參溶菌酶基因工程菌。結(jié)果表明，構(gòu)建的基因工程菌與原始菌株的生長趨勢基本一致，并且外源基因的插入對菌體的生理代謝未造成太大影響；同時在工程菌株穩(wěn)定性上本試驗構(gòu)建的工程菌株在連續(xù)傳5次后遺傳穩(wěn)定性為94%，在提取質(zhì)粒和雙酶切后的結(jié)果表明，構(gòu)建的基因工程菌沒有出現(xiàn)重排或丟失的現(xiàn)象。

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（責任編輯 馬鑫）

Construction of Genetic Recombination for Sea Cucumber Lysozyme in Bacillus subtilis

Sun Lu Liu Zhiwen Zou Dan Li Dan Pan Bo Cong Lina
（College of Bioengineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034）

The expression of lysozyme from sea cucumber Stichopus japonicus in Bacillus subtilis were constructed by the method of recombinant DNA technique, and the expression plasmid pHT43-SjLys of growth curve and stability were analyzed. Results showed that a specific strip about 400 bp was visible in the result of agarose gel electrophoresis, which was consistent with expected size of sea cucumber lysozyme gene. Construction of the lysozyme was performed in a vector pHT43 and validated by double digestion with BamHⅠand SmaⅠ, witch indicated the fragment size was consistent with the expected result. The growth trend of engineering bacteria was consistent compared with the wild type strain WB600, and insertion of foreign genes did not affect the cell’s metabolism. In the absence of selection pressure, the recombinant plasmid was stability, and there was no gene rearrangement and lost. The results showed that the recombinant sea cucumber lysozyme genetic engineering bacteria pHT43-SjLys/WB600 is constructed successfully.

Genetic recombination Sea cucumber lysozyme Bacillus subtilis Genetic engineering bacteria Expression vector

2014-01-02

國家自然科學(xué)基金項目（31070164），遼寧省教育廳重大平臺專項（LT2011008），遼寧省自然科學(xué)基金資助項目（20102009）作者簡介：孫璐，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：561166567@qq.com

劉志文，男，博士，副教授，研究方向：海洋生物基因工程菌的開發(fā)和應(yīng)用；E-mail：alzw@dlpu.edu.cn叢麗娜，女，博士，教授，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)的研究和開發(fā)；E-mail：congln@dlpu.edu.cn