張穎穎，車 萍

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250014）

在中醫(yī)院校，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)是一門重要的基礎(chǔ)課程。該課程實驗性強，實驗學(xué)時較多。而菌種管理是一項基礎(chǔ)工作，包括菌種的購買、活化、分離、保藏等環(huán)節(jié)，決定著醫(yī)學(xué)微生物實驗的成功與否。微生物實驗室必須保證實驗用菌種具有較高的純度，穩(wěn)定的生理生化特性，保證菌種在使用中不出現(xiàn)退化、死亡等現(xiàn)象，否則就會影響實驗結(jié)果[1]。因此，需要制定嚴格的菌種使用管理規(guī)定，針對不同實驗要求，選擇合適的菌種，因地制宜采取最合適的菌種純化保藏方法。筆者結(jié)合實驗準備經(jīng)驗，就中醫(yī)院校醫(yī)學(xué)微生物實驗菌種管理工作談一下心得體會。

1 中醫(yī)院校醫(yī)學(xué)微生物實驗常用菌種及其用途

中醫(yī)院校醫(yī)學(xué)微生物課程相對西醫(yī)院校而言比較簡煉，學(xué)時少，但教學(xué)內(nèi)容覆蓋面較廣，還要與中醫(yī)相結(jié)合，因此，其教學(xué)側(cè)重中藥抑菌、中醫(yī)藥抗病毒等方面。具體到菌種的選擇上，革蘭氏陽性細菌有金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、A群鏈球菌、枯草芽胞桿菌、肺炎鏈球菌、破傷風(fēng)梭菌、結(jié)核分枝桿菌、藤黃微球菌等；革蘭氏陰性細菌有大腸埃希菌、志賀菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、傷寒沙門菌、肖氏副傷寒沙門菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌、霍亂弧菌等；真菌如白色假絲酵母等。以上菌種可用于細菌的各種染色法、接種法練習(xí)，觀察各種微生物形態(tài)，進行中藥抑菌實驗等。

2 中醫(yī)院校醫(yī)學(xué)微生物實驗菌種來源

2.1 直接采購

2.1.1 國內(nèi)采購 目前國內(nèi)各大菌種保藏機構(gòu)均提供菌種采購服務(wù)，可按照其網(wǎng)站介紹進行購買，往往以安瓶等形式提供菌種。國內(nèi)幾大菌種保藏機構(gòu)，如中國普通微生物菌種保藏管理中心、中國微生物菌保藏管理委員會普通微生物中心、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心等，均出售菌種；另有各生物公司均提供進口與國產(chǎn)菌種服務(wù)；一般省級防疫中心也提供菌種服務(wù)。

2.1.2 國外采購 國外方面，如ATCC（American Type Culture Collection，美國典型菌種保藏中心）、NBRC（NITE Biological Resource Center，日本技術(shù)評價研究所生物資源中心）、DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，德國微生物菌種保藏中心）、CBS（Centraalbureauvoor Schimmelcul-tures，荷蘭微生物菌種保藏中心）等都提供菌種服務(wù)，但其缺點在于價格昂貴、郵寄繁瑣、耗時較長，因此不適用于學(xué)生實驗。

2.2 自行分離

訂購標準菌種簡單方便，但也存在價格較高、程序繁瑣等問題，如ATCC菌種價格通常為800元以上，國內(nèi)菌種亦不低于200元。再者，若進行臨床相關(guān)微生物研究，就必須準備臨床分離菌種。因此，在微生物實驗中，自行分離也是菌種的重要來源之一。如可從空氣中分離葡萄球菌、藤黃微球菌，自口腔分離白色假絲酵母，從腸道中分離大腸埃希菌及其他腸桿菌等。在教學(xué)中，我們結(jié)合SRT（大學(xué)生研究訓(xùn)練）項目等學(xué)生活動，從環(huán)境中分離了藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌等常見菌種，既可用于實驗教學(xué)，也可培養(yǎng)學(xué)生的動手能力。

2.3 從醫(yī)院獲得臨床菌株

中醫(yī)院校通常與相關(guān)醫(yī)院有密切聯(lián)系。臨床病患體內(nèi)外分離的菌株具有典型的致病性，便于結(jié)合臨床進行教學(xué)，故此亦可成為菌種的重要來源之一。我校微生物教研室現(xiàn)有幾十株從臨床分離的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌（含MRSA等耐藥菌株）、銅綠假單胞菌、痢疾志賀菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌等臨床菌株。但該法獲得的菌株一般毒性較強，通常僅限于科研應(yīng)用，在實驗教學(xué)中使用時需注意生物安全，保存條件應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定。

2.4 致函索要

可在網(wǎng)絡(luò)上檢索相關(guān)文章，通過致函菌種擁有者索要菌株。國外眾多科研機構(gòu)可免費分享自己的菌種，有些需要簽署保密協(xié)議，不得用于商業(yè)用途等。該法多用于科研。

3 實驗菌種的復(fù)活、傳代、純化工作

3.1 外購菌種

若采用外購菌種，復(fù)活和傳代是必備的基本操作。可以將適量液體培養(yǎng)基滴入安瓿瓶中，溶解菌種并接種于對應(yīng)培養(yǎng)基上，在適宜條件下進行培養(yǎng)，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)等鑒定為純種后方可投入實驗應(yīng)用。在此過程中必須保證菌種的純度及性狀穩(wěn)定，如發(fā)現(xiàn)污染或菌種不純，則應(yīng)通過劃線分離操作將其進一步純化，重新分離挑選純菌落[2]。

3.2 自行分離菌種

自行分離菌種時，復(fù)活步驟無需考慮，重在菌種的鑒定、純化、傳代和保藏。其中鑒定工作可查閱相關(guān)資料，如《伯杰氏細菌手冊》等權(quán)威工具書，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生化反應(yīng)及免疫學(xué)檢驗等確定菌株，并通過選擇培養(yǎng)基和劃線分離等手段進行純化。各項指標均應(yīng)符合規(guī)定，以保證菌株鑒定的準確性。

4 實驗菌種常用保藏方法

由于條件所限，中醫(yī)院校在實驗設(shè)備上往往與西醫(yī)院校有一定差距，因此，如何針對實際情況采取合適的菌種保藏方法，也是需要重點思考的問題。常用菌種保藏方法有6類，分別是定期移植保藏法、液體石蠟覆蓋保藏法、試管熔封保藏法（試管密封法）、干燥法、冷凍真空干燥法和液氮超低溫保藏法。在此，筆者結(jié)合實際條件，在充分查閱文獻的基礎(chǔ)上選取了幾種常用且簡單易行的保藏法，并做了適當(dāng)改進，收到了較好效果，現(xiàn)介紹如下。

4.1 定期移植保藏法

學(xué)生實驗中大量使用的菌種一般使用該法保藏。具體操作為斜面低溫保藏，即以無菌操作將菌種轉(zhuǎn)種于新鮮培養(yǎng)基斜面上，經(jīng)鑒定菌種純度及生理生化性狀符合要求后置于4～6℃冰箱中低溫保存。此法適用于要求不高，但菌種需求量較大的革蘭氏染色、細菌接種、藥物敏感實驗等。

4.2 液體石蠟覆蓋保藏法

該法是一種改良的傳代培養(yǎng)方法，通常將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基上，取培養(yǎng)后生長良好的斜面，加入無菌石蠟油沒過培養(yǎng)基最上端約1 cm，包裹牛皮紙后將其放置于4℃冰箱低溫保存。外購菌種經(jīng)該法轉(zhuǎn)種保藏后可保證1～2年內(nèi)菌種性狀不變。因此，該法適用于普通微生物實驗室菌種保藏。近年來我校購進菌種部分為試管斜面保存，故我們在實踐中廣泛采用該法對菌種進行保存，收到了較好效果，可保證1年內(nèi)菌種的性狀穩(wěn)定。

4.3 動物組織保藏法

王丹敏[3]等用含菌鼠肝保存肺炎鏈球菌取得成功。因此可用含菌動物組織于-20℃環(huán)境下進行菌種保存，其保藏時間可達18～20個月。經(jīng)實踐驗證，該法對某些抵抗力較弱的致病性細菌有效。

5 總結(jié)

做好醫(yī)學(xué)微生物實驗菌種管理工作，必須制定嚴格的操作程序，完善相關(guān)制度，實施規(guī)范操作，不斷總結(jié)經(jīng)驗以提高管理水平。

5.1 嚴格菌種管理制度，盡可能購買高質(zhì)量菌種

國內(nèi)外各機構(gòu)、公司均可提供菌種服務(wù)，但質(zhì)量不盡相同。如ATCC標準菌種雖價格較貴，但質(zhì)量穩(wěn)定，用于要求較高的科研實驗較為合適；國標CMCC菌株經(jīng)濟性較好，質(zhì)量也有保證，亦是較好的選擇；也有個別公司提供的菌種存在污染等現(xiàn)象，筆者在工作中曾遇到此類情況，后通過分離純化保證了實驗的正常進行。科研工作中如需臨床分離的非標準菌種，則可向國外同行致函索要，往往能得到滿意的結(jié)果。

5.2 注重生物安全，做好高致病性菌種保管工作

醫(yī)學(xué)微生物實驗對操作要求較高，要求實驗室建立完整嚴格的管理規(guī)范，做好菌種管理工作。由專人負責(zé)，使用時嚴格無菌操作，防止菌種污染。此外還要按照正確的方法進行菌種傳代保藏，以免菌種退化。

5.3 從實際出發(fā)，根據(jù)實驗室條件制定合適的保藏策略

菌種保藏方法多樣，對實驗條件要求各不相同，通常越復(fù)雜的方法保藏效果越好。本文所述之法均簡單易行，一般條件的微生物實驗室均能滿足，且經(jīng)實踐證明完全能滿足中醫(yī)院校醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教學(xué)要求。如需進行深入研究，則可視情況采用較為復(fù)雜的保藏法。

總之，在中醫(yī)院校，完善的菌種管理是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教學(xué)科研工作順利開展的前提。微生物實驗室應(yīng)盡可能做好菌種庫建設(shè)工作，既要有常用標準菌株，也應(yīng)收集部分臨床菌株，保證滿足教學(xué)科研需求。這就要求我們在工作中注重菌種收集，因地制宜采用最合適的保藏法，注重經(jīng)濟性與實用性的結(jié)合，有效提高菌種的使用效率。同時，近年來生物安全的重要性日益凸顯，為保證菌種的安全使用，必須建立健全管理制度，嚴格消毒滅菌程序，防止出現(xiàn)安全事故。