羅銳軍， 陸 春， 李紀兵

(中山大學 附屬第三醫(yī)院皮膚性病科，廣東 廣州 510630)

生物膜耐藥機制研究進展

羅銳軍， 陸 春*， 李紀兵

(中山大學 附屬第三醫(yī)院皮膚性病科，廣東 廣州 510630)

生物膜形成是微生物耐藥的重要原因之一，也是許多慢性感染性疾病反復發(fā)作和難以治療的主要原因，微生物生物膜可以通過滲透限制，改變生物膜內外微環(huán)境，形成特殊的基因型等多種方式導致耐藥。生物膜耐藥機制的研究已成為醫(yī)學、藥學、微生物學等眾多領域關注的課題。就生物膜耐藥機制的最新進展進行綜述。

生物膜；耐藥機制

生物膜(Biofilm，BF)是指微生物在生長過程中附著于物體表面形成的由微生物的細胞及其分泌的聚合物(Extracellular polymeric substances，EPS)所組成的多細胞復合體[1]。生物膜由多種有機物組成，包括多糖、蛋白質、核酸、磷脂、褐藻酸、腐質等，主要成分是多糖和蛋白質[2]。生物膜在自然界中很常見，輸水系統(tǒng)、食品加工、航運等領域都可見到微生物生物膜的影響。研究表明，大多數(shù)微生物，如細菌、真菌、支原體等都可以形成生物膜，微生物形成生物膜后，其生物學特性可發(fā)生改變，包括營養(yǎng)代謝、生長率等，其中最主要的是耐藥性的改變。目前生物膜引起的微生物耐藥明顯增加，約65%的人類感染與生物膜有關[3]，更有學者認為超過80%的人類感染中有生物膜的形成[4]。本文就一些常見微生物生物膜形成可能的耐藥機制的最新進展進行綜述。

1 生物膜可能的耐藥機制

1.1滲透限制學說

牙周炎和囊性纖維化病人的慢性肺部感染都是我們熟悉的與生物膜形成有關的疾病[5-6]。即使在免疫功能正常的人體內，生物膜介導的感染也很難治愈，易形成慢性感染。Anderl JN等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，β-內酰胺酶陰性的肺炎克雷伯菌，對氨芐青霉素的最小抑菌濃度為2 μg/mL，但當生成生物膜以后， 5000 μg/mL氨芐青霉素水溶液作用4 h，仍有66%的細菌存活，這個劑量可以完全根除游離狀態(tài)的細菌。當細菌從生物膜中游離出來時，它們對抗生素又馬上變得敏感起來,由此推測可能是覆蓋在細菌表面的生物膜構成的外部屏障，限制或減緩了抗生素的滲入，使生物膜中的細菌逃離了宿主免疫反應，抵抗抗菌素的藥物作用[8-9]。另有研究者[10]利用微量液基稀釋法測定22株曲霉游離孢子對兩性霉素B的敏感性，同時建立22株曲霉生物膜的體外模型，用抗真菌藥物敏感試驗聯(lián)合甲基四氮鹽(2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-((phenylamino)carbonyl)-2H-tetrazolium hydroxide,XTT)減低法來評價曲霉生物膜對兩性霉素B的敏感性，結果顯示，對曲霉游離孢子，兩性霉素B的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)范圍是0.5～2 μg/mL，對于曲霉生物膜，兩性霉素B的SMIC50(亞最低抑菌濃度50)和SMIC80(亞最低抑菌濃度80)范圍分別是2～>32 μg/mL和8～>32 μg/mL，與游離的孢子相比，曲霉生物膜對兩性霉素B的敏感性明顯下降。生物膜的屏障作用除了物理屏障之外，還存在電荷屏障,Hoiby N等[11]研究表明，氨基糖苷類抗生素因帶有正電荷,易被生物膜中帶有負電荷的藻酸鹽復合物吸引而阻止其滲透,且固定在BF基質中的抗生素水解酶可滅活進入被膜的抗生素，從而使耐藥性大大增強。

1.2營養(yǎng)限制和生物膜內外環(huán)境不均一學說

Leung CY等[12]在研究抗微生物藥物在微生物游離階段、附著階段、生物膜形成階段的作用時發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌和念珠菌在游離階段對標準劑量的藥物濃度反應敏感，在附著階段和生物膜形成階段對藥物的敏感性降低，生物膜形成以后，運用PCR檢測發(fā)現(xiàn)過氧化物酶1(Superoxide Dismutase-1,SOD1)和過氧化氫酶1 (Catalase-1，CAT1)的表達量都較前增高，推測大腸埃希菌和白色念珠菌生物膜的耐藥性與高抗氧化能力相關。另外，生物膜由內到外存在一個營養(yǎng)濃度梯度，De Beer D[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，外界的氧氣在生物膜外部就已經被基本消耗，導致生物膜內部的細菌缺氧，這種缺氧的細菌對抗生素的敏感性顯著下降，抗生素很難殺死生物膜內的缺氧細菌。另一方面，局部酸性代謝產物的積聚，導致生物膜內外pH值差距較大，可以直接抵抗抗生素的作用。也有人認為，這種營養(yǎng)物質的消耗和代謝廢物的堆積，可以使一部分細菌處于非增殖狀態(tài)，而抗生素很難殺滅這種處于非增殖期的細菌[14],比如青霉素這種作用于細胞壁的抗生素，就只對生長期的細菌有殺滅作用，而對于靜止期細菌作用不大。

1.3基因型在生物膜耐藥方面的作用

研究表明，處于生物膜內的細菌與游離的細菌在基因型上是有所差異的，這種差異主要表現(xiàn)在某些基因表達量的不同[15]。Garcia-Sanchez S等[16]對白色念珠菌和煙曲霉菌生物膜形成前后做了一個詳盡的基因表達分析，發(fā)現(xiàn)生物膜內細菌某些基因的表達量高于游離的細胞。比如說，在煙曲霉菌的多重耐藥中，MDR1、 MDR2、MDR4基因出現(xiàn)上調，而白色念珠菌多重耐藥菌株，則可發(fā)現(xiàn)MDR1、CDR1、 CDR2等基因的上調[17]。另外，生物膜的另一個特性是黏附相關基因的表達量增加，ALS1是在白色念珠菌形成生物膜之后最主要的上調的黏附相關基因,Garcia-Sanchez S在2004年提出，ALS1在生物膜的形成中有獨立的作用;Nett JE[18]在2009年觀察到，ALS1基因的表達在生物膜形成的不同階段有不同的表達。另外，還有一些與細胞壁形成有關的基因的異常表達和調節(jié)也參與生物膜的形成，如真菌中編碼β-1,3葡聚糖的FKS1、BGL2和 XOG1等。真菌生物膜導致的耐藥與基因表型密切相關，在細菌中也是如此。Uhlich GA等[19]在研究大腸埃希菌血清型O157∶H7菌株生物膜形成后對過氧化氫耐藥時，選用大腸埃希菌的變異菌株ATCC 43895(EDL933)，用基因敲除的方法敲除katG、ahpC、katE 和katP基因后，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌無論在指數(shù)生長期還是在37℃培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24 h后，對過氧化氫的耐藥性都小于基因敲除前生物膜內的細菌，并且發(fā)現(xiàn)生物膜內細菌的耐藥性要遠遠高于游離的細菌。盡管基因介導的生物膜耐藥理論涉及微生物的實質，但要以此完全闡述生物膜的耐藥機制，理論依據(jù)不夠充分，有研究者[20]采用96孔微量培養(yǎng)板進行白色念珠菌生物膜的培養(yǎng),用MTT法檢測其對氟康唑的敏感性，并用半定量RT-PCR法測定生物膜形成不同時期CDR1、CDR2及MDR1基因表達的差異性，結果白念珠菌生物膜在較早期(2 h)對氟康唑仍然敏感，隨著白念珠菌生物膜的不斷成熟，其耐藥性不斷增高；CDR1及CDR2基因在生物膜形成的早中期及成熟期的表達明顯上調，尤其早期的高表達更為明顯，而MDR1基因的表達只在生物膜形成早期有明顯的高表達，從這個實驗可以看出，白念珠菌生物膜的耐藥性隨著其結構的成熟而不斷增高，CDR1、CDR2及MDR1基因在生物膜形成早期有明顯的高表達，但與生物膜耐藥性的增加并不一致。因此，生物膜的耐藥性可能是多種機制作用的結果。

1.4熱休克蛋白對于某些微生物生物膜耐藥的影響

生物膜的耐藥機制復雜，不能只用其中一種機制來解釋。近年來，有人發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白在某些微生物生物膜的形成和耐藥方面起一定作用。Nicole Robbins等[21]于2012年闡述了分子伴侶熱休克蛋白90(heat shock protein 90， HSP90)在生物膜的分布和耐藥性方面起關鍵的調節(jié)作用。在人類真菌感染的主要病原體白色念珠菌中，HSP90通過穩(wěn)定蛋白磷酸酶和MAPK Mkc1通路使游離真菌產生和維持耐藥。HSP90 還可以通過抑制cAMP-PKA信號傳導通路來調節(jié)溫度依賴性白色念珠菌的形態(tài)。敲除HSP90相關基因后，生物膜的生成和成熟較前明顯減少，并且對于臨床上應用最多的抗真菌藥—唑類藥物的耐藥性降低。但是HSP90介導生物膜的耐藥機制在微生物不同的細胞狀態(tài)中亦有所不同，研究表明HSP90消耗后減少了游離菌中蛋白磷酸酶和MAPK Mkc1的表達，但生物膜形成后的真菌消耗HSP90后，蛋白磷酸酶和MAPK Mkc1的表達并沒有減少。另外，HSP90水平下調后，生物膜矩陣中葡聚糖的水平顯著下降。在大鼠靜脈導管的生物膜感染模型中，減弱HSP90的功能可以使生物膜中真菌對氟康唑的敏感性從不敏感轉變?yōu)楦叨让舾小嵝菘说鞍撞粌H在真菌生物膜耐藥機制中起重要作用，在其他微生物中也扮演重要角色。Zarankiewicz T等[22]在研究嗜組織菌引起的機會性感染中證實，熱休克蛋白60(heat shock protein 60， HSP60)在嗜組織菌體外生物膜形成及耐藥中起重要作用，在培養(yǎng)基中加入抗HSP60抗體后，生物膜的生長被抑制。熱休克蛋白在生殖道支原體感染中的作用亦有報導，但其與支原體生物膜形成及耐藥相關機制中的作用仍有待研究。

1.5其他可能的生物膜耐藥機制

除了上述幾種常見的耐藥機制之外，還有其他可能的機制。例如，細菌密度感應系統(tǒng)作用，有研究者認為，細菌通過互相傳遞一種胞外低相對分子質量的自誘導素(也稱信息素)，調節(jié)自身的基因表達，促使其黏附、聚集，進而形成完整的生物膜，當生物膜內的細菌數(shù)量過多時，密度感應系統(tǒng)會使一部分微生物從生物膜表面脫離，導致感染擴散或復發(fā)，引起臨床癥狀[23]。另外有學者認為，細胞內蛋白酶也與生物膜的形成和耐藥有一定關系，在銅綠假單胞菌中，誘導與蛋白酶相關的PfpI、ClpS和ClpP蛋白突變，可以影響其生物膜的形成[24]。其他的一些耐藥機制，如分泌相應藥物的水解酶，激活微生物的應激反應，啟動微生物對藥物的外排泵系統(tǒng)，對抗機體的免疫防疫體制等。均參與解釋和完善了微生物生物膜形成后耐藥性的增加。

2 展 望

微生物生物膜相關感染復雜難治，是多種耐藥機制共同作用的結果，生物膜的形成作為微生物的一種生存戰(zhàn)略，對藥物耐藥性增加的原因是多方面的，不僅因為生物被膜的物理屏障作用，生物膜內微環(huán)境的變化，營養(yǎng)成分的改變，不同的基因表型，微生物感應系統(tǒng)等都在生物膜的形成和耐藥方面起綜合作用。生物膜耐藥是臨床感染慢性和復發(fā)的重要原因，它的形成和耐藥機制的復雜性決定了生物膜相關性感染的臨床治療極為困難，所以控制生物膜相關感染和耐藥顯得尤為重要，相對于其他研究，生物膜研究起步較晚，仍然存在很多問題有待解決，如更確切的耐藥機制，多種微生物復合生物膜的特性和治療，生物膜信號傳導系統(tǒng)的建立等。隨著人們對生物膜研究的深入以及基因芯片、蛋白質組學等新技術的問世,生物膜耐藥機制的研究將不斷完善。

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AdvancedinDrugResistanceMechanismofBio-Membrane

LUO Rui-jun,LU Chun,LI Ji-bing

(3rdAffil.Hosp.ofSunYat-senUniv.,Guangzhou510630)

The formation of bio-membrane (BM) is one of the important reasons for microorganisms to resist drugs,it is also the main reason that many chronic infectious diseases break out repeatedly and difficult to treat.In recent years,there are more and more researches on BM drug resistance mechanism.A variety of ways lead to drug resistance of BM,such as limiting penetration,changing the biofilm internal and external environment and forming a special genotype,etc.The research of BM drug resistance mechanism has become a topic in medicine,pharmacy,microbiology and many other fields.The latest progress in the BM drug resistance mechanism is summarized in this paper.

bio-membrane (BM); drug resistance mechanism

廣東省自然科學基金(S2011010004709)

羅銳軍 女，碩士研究生。研究方向為皮膚病與性病學。Tel：020-85253017，E-mail：luoruijun28@126.com

* 通訊作者。男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師。研究方向為性病學。Tel：020-85253017，E-mail: luliyuan@tom.com

2013-06-05；

2013-06-19

Q939.93；Q73

A

1005-7021(2014)01-0092-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.01.018