王桐梅，錢冬萌，胡 明，李 玲，張 麗，陳 豪，楊 瑞，王 斌

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東青島 266071)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)屬皰疹病毒β亞科，是人類皰疹病毒中基因組最大的一種病毒［1］。研究發(fā)現(xiàn)，HCMV在膠質(zhì)瘤中有很高的感染率，且HCMV可誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和關(guān)鍵細(xì)胞通路功能障礙［2］。但HCMV在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。有研究者提出腫瘤調(diào)節(jié)作用以解釋HCMV感染在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中的作用，腫瘤調(diào)節(jié)作用即HCMV能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)節(jié)腫瘤的惡性行為［3］。轉(zhuǎn)錄激活因子5(Activating transcription factor 5，ATF5)是一個(gè)在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡方面有廣泛的作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，HCMV即刻早期基因和ATF5都能夠與核轉(zhuǎn)錄因子連接器相互結(jié)合發(fā)揮作用［5］。因此推測:HCMV感染促神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖可能與ATF5信號通路有關(guān)。本研究擬探討HCMV感染對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中細(xì)胞增殖及ATF5通路的影響，為進(jìn)一步闡明HCMV感染在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中的相關(guān)分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞 HCMV AD169毒株由法國巴斯德研究所贈送，按常規(guī)方法傳代，滴定(108PFU/mL)。人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)由本室保藏，用于HCMV病毒擴(kuò)增。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87購自上海細(xì)胞庫，按常規(guī)方法培養(yǎng)、傳代，第5代后細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。ATF5的siRNA重組慢病毒(LV-ATF5-RNAi)由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。ATF5的 shRNA靶序列:LV-ATF5-RNAi(8842-1)5'-GCGAGATCCAGTACGTCAA-3'，LV-ATF5-RNAi(8843-1)5'-TCTTGGATACTCTGGACTT-3'，LV-ATF5-RNAi(8844-1)5'-TGGAACAGATGGAAGACTT-3'。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS，Hyclone)、MEM(Hyclone)、噻唑藍(lán)(MTT，Sigma)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma)、SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士)、Trizol(TaKaRa)、Go Taq?qPCR Master Mix(Promega)、Anti-Cytomegalovirus IE(ViroStat)、Anti-ATF5 antibody(abcom)、HRP山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG、BIO RAD Real-time PCR儀(MyiQTM2 Optics Module)、蛋白凝膠電泳系統(tǒng)(韋伯)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期的U87細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(密度:5×103cell/孔)，每孔100 μL。分別設(shè)立HCMV感染組、正常細(xì)胞組及調(diào)零組，各組5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，更換2%MEM，孵育2 h后加入HCMV(MOI=5)，病毒感染0、12、24、48 h后，棄原培養(yǎng)液，每孔分別加入10 μL 5 g/L MTT(3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍(lán))和90 μL MEM，孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置SUNRISE酶標(biāo)儀上，振蕩10 min后，測495 nm波長下的吸光度A值。計(jì)算細(xì)胞增殖率，表示細(xì)胞活性。細(xì)胞增殖率=(感染細(xì)胞A值－調(diào)零孔A值)/(對照組細(xì)胞A值－調(diào)零孔A值)。

1.2.2 熒光定量PCR檢測HCMV感染U87細(xì)胞株ATF5 mRNA的表達(dá)水平變化 Trizol法提取HCMV 感染U87 0、12、24、48 h 細(xì)胞RNA，紫外分光光度計(jì)定量。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按PrimeSCript RT reagent Kit With gDNA Eraser說明書操作，產(chǎn)物cDNA置于－20℃。Real-time PCR采用β-actin作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因與目的基因各設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)管。引物由上海生工生物有限公司合成，序列見表1。反應(yīng)體系為20 μL，其中10 μL SYBR green mixture，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加水至20 μL。95℃ 3 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s，循環(huán)40次。55℃，30 s時(shí)讀取熒光值。

表1 本研究中Real-time PCR所用引物及產(chǎn)物長度Table1 Sequence of the Primers and length of products

1.2.3 蛋白提取及 Western-blotting HCMV感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞0、12、24、48 h后，用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入400 μL 含有1 μmol/L PMSF 的細(xì)胞裂解液，冰浴30 min后，12 000 r/min 4℃離心10 min，上清液為總蛋白，檢測該組總蛋白中ie，ATF5蛋白表達(dá)水平變化。每上樣孔上樣30 μg總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別按要求稀釋后加入β-actin，ie和ATF5抗體4℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10 min。再加入HRP-標(biāo)記的二抗。室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光。以β-actin作為內(nèi)參，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)含量。

1.2.4 慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件優(yōu)化及干擾靶點(diǎn)的選擇 取生長良好、對數(shù)生長期的U87細(xì)胞，接種于96孔板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)30%～50%時(shí)，分別在正常培養(yǎng)液、正常培養(yǎng)液+Polybrene、正常培養(yǎng)液+EIS及正常培養(yǎng)液+EIS+Polybrene四種條件下感染慢病毒，每種條件設(shè)4個(gè)感染復(fù)數(shù)(MOI值為10、20、30、40)，感染12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換正常培養(yǎng)液，并于感染后48、72、96 h于熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)以確定最佳慢病毒感染條件及感染復(fù)數(shù)。在最佳慢病毒感染條件及感染復(fù)數(shù)條件下，分別將對照慢病毒Li-CON055及含靶向干擾ATF5的小干擾RNA質(zhì)粒的慢病毒LV-ATF5-RNAi(8842)、LV-ATF5-RNAi(8843)和LV-ATF5-RNAi(8844)感染U87細(xì)胞，待穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，提取蛋白，Western-blot檢測細(xì)胞內(nèi)ATF5的表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 HCMV感染對U87細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，與正常對照組細(xì)胞比較，HCMV感染0、12、24、48 h后，細(xì)胞增殖明顯。P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 MTT法檢測HCMV感染對U87細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of HCMV infection on U87 cells proliferation

2.2 HCMV感染對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞ATF5 mRNA表達(dá)的影響

如圖2所示，IE2為HCMV進(jìn)入宿主細(xì)胞后最先表達(dá)的基因，是病毒復(fù)制和其他基因表達(dá)所必需的。同時(shí)，在調(diào)控宿主細(xì)胞某些基因的表達(dá)方面發(fā)揮重要作用。Real-time PCR檢測結(jié)果表明，HCMV感染0、12、24、48 h，隨著IE2表達(dá)的升高，U87細(xì)胞中ATF5表達(dá)水平也升高。表明U87細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)。

圖2 Real-time PCR檢測HCMV感染U87細(xì)胞后IE2、ATF5 mRNA表達(dá)水平Fig.2 Real-time PCR analyses expression levels of IE2，ATF5 mRNA in U87 cells by HCMV infection

2.3 HCMV感染對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞ATF5蛋白表達(dá)水平的影響

HCMV 感染U87 12、24、48 h(圖3、表2)，隨著ie蛋白表達(dá)水平的升高，ATF5蛋白表達(dá)水平升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與Real-time PCR結(jié)果相一致。

圖3 Western-blot檢測HCMV感染U87后，細(xì)胞內(nèi)ie，ATF5蛋白表達(dá)水平Fig.3 Western-blot analyzes the protein level of ie，ATF5 in HCMV-infected U87 cells

表2 HCMV感染后，U87細(xì)胞內(nèi) ie、ATF5蛋白與β-actin灰度比值變化±s)Table2 The relative density of protein bands(Figure3)for ie，ATF5 was calculated using β-actin as a loading control

表2 HCMV感染后，U87細(xì)胞內(nèi) ie、ATF5蛋白與β-actin灰度比值變化±s)Table2 The relative density of protein bands(Figure3)for ie，ATF5 was calculated using β-actin as a loading control

注:與0 h未感染HCMV的U87細(xì)胞相比，*P＜0.05

HCMV感染時(shí)間/h蛋白012 24 48 ie 0 0.20±0.04 0.61±0.04 0.94±0.06 ATF5 0.67±0.04 0.90±0.09 0.92±0.07 1.10±0.06*

2.4 慢病毒感染效率的檢測

如圖4所示，慢病毒感染U87，72 h后在熒光顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的紅色熒光蛋白，以每高倍鏡下熒光細(xì)胞數(shù)/同一視野細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算感染效率。在MOI=40的條件下，慢病毒感染U87細(xì)胞效率達(dá)95%以上。

圖4 慢病毒感染U87細(xì)胞72 h后的光鏡(A)和熒光鏡(B)(40×)Fig.4 The figures photographed by light microscope(A)and fluorescence microscope(B)72 h after the Lentivirus infected the U87 cells(40×)

2.5 ATF5沉默效率的檢測

如圖5、表3所示，Western-blot結(jié)果顯示，LVATF5-RNAi(8842)組U87細(xì)胞ATF5表達(dá)水平有明顯減低，而LiCON055感染組與U87組ATF5表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，慢病毒 LVATF5-RNAi(8842)對U87細(xì)胞內(nèi)源性ATF5表達(dá)水平具有抑制作用。因此，將LV-ATF5-RNAi(8842)感染組用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5 Western-blot檢測慢病毒沉默ATF5效率Fig.5 Western-blot analyzes the efficiency of lentiviral silencing ATF5

表3 慢病毒感染U87細(xì)胞內(nèi)ATF5蛋白與 β-actin比值灰度分析Table3 The relative density of protein bands(Figure 5)for ATF5 to β-actin in the lentiviral infected U87 cells

2.6 HCMV感染對沉默ATF5 U87細(xì)胞增殖的影響

如圖6所示，MTT結(jié)果顯示，與對照組比較，HCMV感染對沉默ATF5 U87細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用(P＜0.05)。

圖6 HCMV對沉默ATF5 U87增殖的影響Fig.6 Cell viability analysis of siATF5 U87 cells by HCMV

3 討論

研究表明，HCMV感染與惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系［6］。Cobbs等［7］首次證明了HCMV核酸和蛋白存在于不同惡性度(Ⅱ～Ⅳ)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，且在該腫瘤中高表達(dá)。HCMV能夠編碼多種病毒基因，其基因產(chǎn)物參與調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)信號通路、轉(zhuǎn)錄因子以及腫瘤抑制蛋白，發(fā)揮其腫瘤調(diào)節(jié)作用［8］。HCMV編碼的即刻早期蛋白(ie)能夠與宿主細(xì)胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子SP1及CREB等相互作用形成復(fù)合物，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄激活［9］。

轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一個(gè)標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞增殖、發(fā)育有密切關(guān)系。ATF5隸屬轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB家族成員之一，具有亮氨酸拉鏈(bZIP)的特征結(jié)構(gòu)域，能與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白分子相互作用，形成復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡［10］。目前，有關(guān)ATF5信號通路在HCMV感染誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的作用，文獻(xiàn)少見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87感染HCMV后，細(xì)胞增殖明顯。提示，HCMV感染能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖。Real-time PCR及Western-blot結(jié)果顯示，HCMV感染48 h后，U87細(xì)胞ATF5表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，顯示細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)。此結(jié)果表明，HCMV感染可能是通過調(diào)控ATF5信號通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖能力。

為進(jìn)一步證明ATF5在HCMV感染中可能的作用，構(gòu)建了靶向ATF5 siRNA慢病毒載體，其感染效率高、維持時(shí)間久，能夠長期抑制目的基因的表達(dá)。沉默U87細(xì)胞內(nèi)源性ATF5后，觀察HCMV感染對siATF5 U87細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，沉默U87細(xì)胞內(nèi)源性ATF5后，可降低U87細(xì)胞增殖活性，與JM Angelastro等［11］的研究相符。與對照組比較，HCMV感染沉默ATF5的U87細(xì)胞，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。結(jié)果表明，切斷ATF5信號通路，能夠在一定程度上抑制HCMV感染對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的促增殖作用。

綜上所述，本研究闡明HCMV感染能夠通過調(diào)控ATF5信號通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞惡性行為。HCMV感染能夠上調(diào)ATF5表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控下游抗凋亡基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，預(yù)防HCMV感染或者下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性ATF5表達(dá)，可作為治療膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)。本研究僅對HCMV感染增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性表型作了初步研究，其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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