杜忠娟，鐘民濤，倫永志，劉 奔，張 偉，王曉麗，李星云，曹 靖，寧安紅，黃 敏*

(1.大連醫(yī)科大學(xué)微生物教研室，遼寧大連 116044;2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116622)

香菇是最著名的食用菌之一，具有很高的營養(yǎng)及藥用價值。近幾十年來，國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了大量的研究，并證明香菇具有抗衰老、保肝降酶、抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用［1-4］。本課題組經(jīng)多年研究篩選得到了香菇C91-3菌株，首次發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵蛋白具有良好的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用［5-7］。為開發(fā)應(yīng)用香菇C91-3菌株抗腫瘤蛋白成分，尋找表達(dá)這些蛋白的基因序列，基于功能基因組學(xué)，首次通過solexa高通量轉(zhuǎn)錄組從頭組裝測序技術(shù)，對香菇菌C91-3的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序工作，獲得轉(zhuǎn)錄組Unigene序列，然后借助生物信息學(xué)工具進(jìn)行其表達(dá)譜的分析比對，成功獲得香菇C91-3的轉(zhuǎn)錄組中大量的Unigene及其功能注釋信息。其中Unigene為28 923條，具有編碼框的Unigene有18 120條［8］。根據(jù)注釋信息，結(jié)合香菇C91-3蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的特點(diǎn)，成功篩選克隆并在畢赤酵母表達(dá)體系表達(dá)出抗腫瘤蛋白24414［9］，繼續(xù)采用同樣的方法篩選出Unigene 14872基因序列(以下簡稱14872)。本研究目的是根據(jù)Unigene 14872基因序列設(shè)計引物，用3'-Full RACE、5'-Full RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法獲得基因全長，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并誘導(dǎo)Unigene 14872基因的蛋白表達(dá)，初步鑒定其抗腫瘤活性，為進(jìn)一步研究重組蛋白的活性及作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 總RNA提取Trizol試劑盒，3'-Full RACE Core Set Ver 2.0、5'-Full RACE Kit、BigDye Terminater V3.1購自invitrogen公司;Cycle Sequencing Kit、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒及實(shí)驗(yàn)所需各種引物、酶類均購自寶生物工程(大連)有限公司;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(XGal)購自TIANGEN公司。酵母提取物、胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 低溫離心機(jī)(Eppendorf，德國)，PCR 擴(kuò)增儀(TaKaRa Thermal Cycler TP600，TaKaRa BIO INC.)，核酸電泳儀(Mupid，ADVANCE-BIO Co.，Ltd)，凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠)，紫外分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.1.3 質(zhì)粒和菌株 克隆載體pMD-19-T Simple Vector購自TaKaRa(大連)公司，表達(dá)載體pET32a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存，宿主大腸埃希菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，用于質(zhì)粒擴(kuò)增，宿主菌JM109購自TaKaRa(大連)公司。

1.2 方法

1.2.1 Unigene14872基因的篩選 對香菇C91-3的轉(zhuǎn)錄組中大量的Unigene基因進(jìn)行功能注釋，成功篩選出Unigene 14872基因。

1.2.2 香菇C91-3菌株總RNA提取與引物設(shè)計取綜合馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d的香菇菌C91-3的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，用Trizol試劑盒按說明一步法提取總RNA，將所得總RNA溶于50 μL DEPC水中。引物設(shè)計采用Oligo 6.0設(shè)計軟件，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，設(shè)計合成3'-RACE、5'-RACE實(shí)驗(yàn)所需特異性引物。實(shí)驗(yàn)所需引物序列見表1。

表1 引物序列Table1 Primers used in the experiment

1.2.3 3'-Full RACE反應(yīng)和5'-Full RACE反應(yīng)應(yīng)用3'-Full RACE Core Set Ver 2.0、5'-Full RACE Kit試劑盒。將3'-Full RACE反應(yīng)和5'-Full RACE反應(yīng)獲得的基因片段拼接并送寶生物(大連)公司測序。

1.2.4 Unigene 14872基因全長的生物信息學(xué)分析 通過DNASTAR軟件包對核酸的編碼產(chǎn)物進(jìn)行分析。再通過Blast對Unigene 14872蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫檢索同源性的蛋白序列進(jìn)行比對，分析其同源性和功能。

1.2.5 亞克隆目的基因Unigene 14872中 Pkinase結(jié)構(gòu)域 ①引物設(shè)計與合成:根據(jù)Unigene 14872中Pkinase的核苷酸序列設(shè)計PCR反應(yīng)引物，并委托寶生物(大連)公司合成，引物序列見表1;②反轉(zhuǎn)錄:使用TaKaRa 3'-Full RACE Core Set Ver.2.0(Code No.D314)合成cDNA。反應(yīng)體系:香菇菌絲體Total RNA 1 μg，3'RACE Adaptor(5 μmol/L)，dNTP Mixture(10 mmol/L each)各1 μL，RNase Free dH2O Up to 7.5 μg。反應(yīng)條件:70℃，10 min，立即冰上放置2 min。然后加入下列組分:5×M-MLV Buffer 2 μL;RNase Inhibitor(40 U/μL)，Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(200 U/μL)各0.25 μL，Total 10 μL。反應(yīng)條件:42℃，60 min;70℃，15 min;③PCR擴(kuò)增:使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:98℃ 10 s，55℃ 10 s，30個循環(huán);70℃ 1 min，72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，再經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。

1.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切pET32a(+)載體，經(jīng)膠回收純化載體后，與同樣雙酶切的目的片段連接，轉(zhuǎn)化JM109，涂布于相應(yīng)抗性平板，挑選陽性菌落植菌，提取質(zhì)粒命名為pET32a(+)-Pkinase。用LB液體培養(yǎng)基加入相應(yīng)的抗生素分別培養(yǎng)含有pET32a(+)-Pkinase質(zhì)粒的陽性菌種。用質(zhì)粒提取試劑盒按照說明書提取質(zhì)粒，用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，然后分別取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliRosetta-gami(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，同時設(shè)立陰性對照，挑取陽性單菌落接入含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8時，向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，于37℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，4℃離心收集細(xì)菌。少部分菌體用于SDS-PAGE電泳和Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)，另外部分菌體經(jīng)4℃離心取沉淀用于目的蛋白純化。

1.2.8 重組蛋白活性的鑒定 將純化、復(fù)性并濃縮后的目的蛋白進(jìn)行微量BCA蛋白定量后，用MTT法檢測細(xì)胞存活和生長情況。將目的蛋白作用的終濃度分別調(diào)整為3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL，以RPMI-1640作為空白對照。評價其對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。用人肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。用0.25%～1%胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)調(diào)整其濃度至5×104～10×104/mL。每孔加入100 μL，邊緣孔用無菌PBS 填充，5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔板)加入上述3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL，濃度梯度的藥物每孔100 μL，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，5%CO2，37℃孵育24、48 h。并倒置顯微鏡下觀察，然后每孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min。在酶標(biāo)儀492 nm處測量各孔的吸光值，參考波長630 nm，按照下面公式計算抑瘤率(細(xì)胞生長抑制率):IR(inhibited rate)=(對照組平均OD值－實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/對照組平均OD值×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Unigene 14872基因全長的獲得

按照方法1.2獲得3'-Full RACE和5'-Full RACE基因片段，再進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(如圖1)進(jìn)行驗(yàn)證。將3'-Full RACE和5'-Full RACE獲得的基因片段拼接，經(jīng)測序Unigene 14872基因全長為2 325 bp。

2.2 序列全長的生物信息學(xué)分析結(jié)果

經(jīng)使用NCBI數(shù)據(jù)庫核苷酸相似性檢索表明，無任何相似性的基因序列，證明此基因?yàn)橐恍滦突?。同時再經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫氨基酸相似性檢索(如圖2)，Unigene 14872蛋白具有Pkinase結(jié)構(gòu)域，Pkinase結(jié)構(gòu)域所對應(yīng)的核酸序列為810 bp，該結(jié)構(gòu)域具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。

圖1 RACE結(jié)果Fig.1 The result of RACE

圖2 Unigene 14872氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫blast結(jié)果Fig.2 The result of Unigene 14872 amino acid sequence blast in NCBI database

2.3 目的基因的獲得

按照方法1.2.4獲得Pkinase結(jié)構(gòu)域目的基因，再進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(如圖3)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

培養(yǎng)連接并轉(zhuǎn)化好的大腸埃希菌JM109宿主菌，按照方法1.2.6，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖4)。

2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

表達(dá)的樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot，結(jié)果見圖5和圖6。圖5中顯示，與陰性對照相比較，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細(xì)胞液中顯現(xiàn)了1條多出的蛋白質(zhì)條帶，分子量約為50 ku，比理論計算值29.7 ku大，這是由于表達(dá)載體pET32a(+)上的編碼序列能合成約16～20 ku的蛋白質(zhì)，所以得到的總蛋白質(zhì)量約為45～50 ku。圖6中顯示，與陰性對照相比較，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細(xì)胞液中顯現(xiàn)了1條特異的蛋白質(zhì)條帶，分子量約為50 ku。SDSPAGE和Western blot結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)出的蛋白為目的蛋白，可以繼續(xù)進(jìn)行下一步純化目的蛋白。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression products

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of expression products

2.6 重組蛋白的抗腫瘤活性

按照方法1.2.8，用MTT 法檢測重組蛋白的活性，結(jié)果見圖7。

圖7 目的蛋白對A549細(xì)胞的MTT檢測結(jié)果Fig.7 The MTT result of the expressed protein to A549

3 討論

為開發(fā)香菇C91-3與抗腫瘤相關(guān)的功能基因，本研究利用提取的香菇C91-3菌株菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過3'-Full RACE反應(yīng)和5'-Full RACE反應(yīng)拼接獲得Unigene 14872基因全長為2 325 bp。并用NCBI中Blast比對，對基因全長進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Unigene 14872蛋白具有Pkinase結(jié)構(gòu)域，所對應(yīng)的核苷酸序列為810 bp。以Pkinase的核苷酸序列作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;由PCR擴(kuò)增后電泳檢測結(jié)果看到樣品有一條810 bp的清晰條帶，濃度較高，擴(kuò)增條件適宜，所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)行回收純化。通過重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，將目的基因成功連接到表達(dá)載體pET32a(+)中。同時將重組好的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌JM109宿主菌保存，質(zhì)粒測序結(jié)果與Blast比對結(jié)果一致，進(jìn)一步證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Pkinase在結(jié)構(gòu)上是含有具有催化功能的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，Pkinase是一組酶，在蛋白質(zhì)的磷酸基團(tuán)上移動，使蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生磷酸化。該功能作為一個開/關(guān)開關(guān)，用于許多細(xì)胞過程，包括代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞凋亡、分化。它們也存在于胚胎發(fā)育、生理反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中。異常磷酸化導(dǎo)致許多人類疾病，包括癌癥，影響磷酸化的藥物可以治療這些疾病［10］。我們已成功克隆、表達(dá)出了Unigene 14872的Pkinase結(jié)構(gòu)域。通過MTT法初步檢測出重組蛋白對人肺癌A549細(xì)胞有顯著地抑制作用，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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