周 雯，李 玲*，于向民*，劉愛(ài)紅，王 斌，錢冬萌，楊 瑞，張志超

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山東青島 266071;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東青島 266071;3.青島大學(xué)病原微生物學(xué)教研室，山東青島 266071)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirous，HCMV)屬皰疹病毒β亞科，核心為雙股線性DNA病毒，在人群中普遍感染，全球人群感染率高達(dá)70%～80%［1］，多呈隱性感染。在發(fā)達(dá)國(guó)家，新生兒HCMV先天感染率高達(dá)0.5%～2.2%，絕大多數(shù)感染者在出生時(shí)無(wú)癥狀，但有5%～15%的感染者在出生后2 a內(nèi)出現(xiàn)視神經(jīng)性耳聾、智力發(fā)育遲緩及視神經(jīng)萎縮等后遺癥［2］。迄今為止，HCMV引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制尚未闡明，對(duì)HCMV感染尚無(wú)特異有效的治療和預(yù)防手段。黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效，在臨床上應(yīng)用廣泛。以往研究對(duì)其主要有效成分黃芩素、黃芩苷以及提取的活性部位的藥理活性多有關(guān)注，主要包括抗病原微生物、抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、抗腫瘤以及對(duì)肝臟、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用等方面［3］。黃芩素(baicalein，BAI)是黃芩的重要單體，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬黃酮類，具有多種藥理作用，在臨床上主要用于抗菌消炎和抗感染［4］，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)黃芩素也有一定的抗病毒作用［5］。目前，國(guó)內(nèi)外研究中，有關(guān)黃芩素的研究報(bào)道較為廣泛，但其抑制HCMV感染人星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究尚未報(bào)道。本研究以人星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，探討黃芩素在HCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中引起IE、pp65 mRNA和蛋白表達(dá)的改變，以闡明其對(duì)HCMV感染神經(jīng)細(xì)胞的抑制作用，為進(jìn)一步研究黃芩素的抗病毒機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)和人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)細(xì)胞株均為本室保藏。HCMV AD169株為法國(guó)巴斯德研究所贈(zèng)送，于HELF細(xì)胞中擴(kuò)增，至細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲病毒，空斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度為108PFU/mL，毒種保存于－86℃。

1.1.2 藥物 黃芩素(baicalein，Sigma)。分子式:C15H10O5;相對(duì)分子量:270.24;DMSO溶解，母液濃度100 mmol/L，分裝后－20℃保存，備用。

1.1.3 試劑及儀器 胎牛血清(FBS，HyClone);DMEM/F12(HyClone);二甲基亞砜(DMSO，Sigma);噻唑藍(lán)(MTT，Amerscso);Go Taq?qPCR Master Mix(Promega);Rabbit Anti-Cytomegalovirus IE(ViroStat);Rabbit Anti-Cytomegalovirus PP65(博奧森);SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士);BIO RAD Realtime PCR儀(MyiQTM2 Optics Module);OLYMPUS FV1200型激光共聚焦顯微鏡(日本)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人星形膠質(zhì)細(xì)胞AS由神經(jīng)干細(xì)胞分化而來(lái)，采用含10%FBS的DMEM/F12，于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，48 h換液，3 d傳代。使用第3代和第4代細(xì)胞并且長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)AS細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AS細(xì)胞均勻接種于96孔板(密度約1×105cell/孔)，每孔100 μL。分別設(shè)立對(duì)照組，BAI組，BAI+HCMV組和HCMV組，各組5個(gè)復(fù)孔。24 h后棄去培養(yǎng)液，BAI組和BAI+HCMV組加入100 μL含不同濃度(10、20、40、80、160 μmol/L)由2%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液配制的BAI，HCMV組和對(duì)照組加入等體積2%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。4 h后BAI+HCMV組和HCMV組加入HCMV(MOI=5)，BAI組和對(duì)照組只加入等體積的DMEM/F12培養(yǎng)液。分別在病毒感染后0、24、48、72 h后棄上清，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)和90 μL DMEM/F12，避光培養(yǎng)4 h后棄掉培養(yǎng)上清液，加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。使用SUNRISE酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在492 nm波長(zhǎng)處的OD值，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)立調(diào)零孔(不含細(xì)胞)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 RNA提取與Real-Time PCR 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AS細(xì)胞接種細(xì)胞培養(yǎng)皿(密度約105/mL)，培養(yǎng)24 h后加入含20 μmol/L BAI的2%DMEM/F12培養(yǎng)液，4 h后加入HCMV 120 μL(MOI=5)，分別培養(yǎng)48、72 h后收集細(xì)胞，設(shè)置相同檢測(cè)點(diǎn)病毒感染組細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。用Trizol試劑按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。兩步法Realtime PCR，第一步，AMV Reverse Transcription System Kit試劑盒擴(kuò)增第一鏈cDNA，第二步為PCR擴(kuò)增，IE1、IE2、pp65基因和β-actin引物均由上海生工合成。IE1基因引物序列:IE1-F:CAAGTGACCGAGGATTGCAA，IE1-R:CACCATGTCCACTCGAACCTT。IE2基因引物序列:IE2-F:TGACCGAGGATTGCAACGA，IE2-R:CGGCATGATTGACAGCCTG。pp65基因引物序列:pp65-F:GTC AGC GTT CGT GTT TCCCA，pp65-R:GGGACACAACACCGTAAAGC。β-actin引物序列:β-actin-F:TGGAACGGTGAAGGTGACAG，β-actin-R:GGCTTTTAGGATGGCAAGGG。應(yīng)用BIO RAD實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性2 min，95℃ 10 s、55℃ 30 s、70℃ 30 s擴(kuò)增，循環(huán)40次，繪制溶解曲線。以雙ΔCt值法計(jì)算各組各時(shí)間點(diǎn)IE1、IE2、pp65cDNA模板數(shù)和βactin模板數(shù)比值。

1.2.4 細(xì)胞爬片與免疫熒光 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AS細(xì)胞接種到含已包被玻片的24孔板內(nèi)(密度約105/mL)，培養(yǎng)24 h后加入含20 μmol/L BAI的2%DMEM/F12，對(duì)照組加入等量的2%DMEM/F12培養(yǎng)液，4 h后加入HCMV 20 μL(MOI=5)，分別培養(yǎng)48、72 h后多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%Trionx-100室溫透化30 min，10%山羊血清室溫封閉30 min，過(guò)夜孵育小鼠抗HCMV IE蛋白單克隆抗體和兔抗HCMV pp65多克隆抗體，PBS充分洗滌后，與FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG 37℃孵育2 h，hoechst室溫染核10 min，75%甘油封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5 蛋白提取與Western blot 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AS細(xì)胞接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶(密度約105/mL)，培養(yǎng)24 h后加入含20 μmol/L BAI的2%DMEM/F12培養(yǎng)液，4 h后加入HCMV 120 μL(MOI=5)，分別培養(yǎng)1、2、3、4 d后收集細(xì)胞，設(shè)置相同檢測(cè)點(diǎn)病毒感染組細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，不染毒細(xì)胞作為陰性對(duì)照。提取總蛋白，檢測(cè)IE1和IE2蛋白的變化，鼠抗IE抗體稀釋比例1∶800，兔抗βactin稀釋比例1∶1 000，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG稀釋比例為1∶2 500。Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，以目的條帶與內(nèi)參灰度比值為其相對(duì)表達(dá)含量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間均數(shù)比較用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較選用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組AS細(xì)胞增殖結(jié)果比較(表1)

不同處理組之間的差別具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.265，P＜0.05)。20 μmol/L BAI+HCMV組感染24、48和72 h后的MTT值均高于HCMV組(P＜0.05)。因此，選取20 μmol/L BAI進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。

表1 BAI組、BAI+HCMV組、HCMV組和對(duì)照組AS細(xì)胞MTT值的變化±s)Table1 Changes of MTT value in different groups±s)

表1 BAI組、BAI+HCMV組、HCMV組和對(duì)照組AS細(xì)胞MTT值的變化±s)Table1 Changes of MTT value in different groups±s)

HCMV感染時(shí)間/h 0.453±0.017 10 mol/L BAI 0.192±0.013 0.234±0.004 0.288±0.029 0.433±0.020 20 mol/L BAI 0.192± 0.013 0.279±0.021 0.302±0.005 0.417±0.024*40 mol/L BAI 0.192±0.013 0.307±0.019＊＊ 0.328±0.015 0.389±0.029 24 48 72 control 0.192±0.013 0.250±0.009 0.312±0.011組別0＊＊

續(xù)表

2.2 各組細(xì)胞感染HCMV48、72 h的形態(tài)學(xué)觀察(圖1)

與對(duì)照組相比，HCMV組細(xì)胞感染后逐漸出現(xiàn)融合，細(xì)胞間隙變大，48 h后出現(xiàn)較為明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)。而20 mol/L BAI+HCMV組細(xì)胞感染48 h融合較少，且大部分細(xì)胞仍為正常形態(tài)。單獨(dú)BAI組對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。

圖1 各組AS細(xì)胞感染HCMV 48、72 h的形態(tài)學(xué)變化(100×)Fig.1 Morphological changes of AS cells in different groups(100×)

2.3 各組細(xì)胞感染HCMV48 h和72 h的IE1、IE2和pp65基因 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化比較(圖2)

各組細(xì)胞在各時(shí)間段均有IE2、pp65的表達(dá)，并且BAI+HCMV組明顯低于HCMV組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4 各組細(xì)胞感染HCMV48、72 h時(shí)免疫熒光檢測(cè)IE和pp65蛋白水平變化(圖3)

各組均有IE、pp65蛋白的表達(dá)，其中BAI+HCMV組的pp65的熒光亮度明顯弱于HCMV組，IE的表達(dá)量也弱于HCMV組，但其降低強(qiáng)度弱于pp65。

圖2 BAI+HCMV組和HCMV組IE1、IE2、pp65 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of IE1，IE2，pp65 mRNA in HCMV group and BAI+HCMV group

圖3 各組AS細(xì)胞感染HCMV 48、72 h時(shí)IE、pp65蛋白熒光圖(100×)Fig.3 Expression of IE，pp65 protein in each group by immunoflurescence assay(100×)

2.5 各組細(xì)胞感染HCMV1、2、3和4 d時(shí)Western blot檢測(cè)IE1、IE2蛋白水平的變化(圖4，表2)

正常細(xì)胞組沒(méi)有IE1、IE2蛋白的表達(dá)，HCMV感染組細(xì)胞均有IE1蛋白表達(dá)，而IE2在病毒感染第1天時(shí)基本觀察不到，灰度于背景色相似。BAI+HCMV組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)IE1和IE2蛋白的表達(dá)量明顯弱于HCMV組(P＜0.01)。

圖4 各組AS細(xì)胞感染HCMV不同時(shí)間點(diǎn)IE1、IE2蛋白的表達(dá)變化Fig.4 Changes of IE1，IE2 protein in different group after HCMV infection

表2 不同處理組AS細(xì)胞的IE1、IE2蛋白與β-actin灰度比值的變化(±s)Table2 The relative value of IE1，IE2 protein in different groups(±s)

表2 不同處理組AS細(xì)胞的IE1、IE2蛋白與β-actin灰度比值的變化(±s)Table2 The relative value of IE1，IE2 protein in different groups(±s)

注:與HCMV 組比較，*P＜0.05，＊＊ P＜0.01

HCMV組BAI+HCMV 組組別1 d 2 d 3 d 4 d 1 d 2 d 3 d 4 d IE1 0.93±0.13 1.11±0.04 0.92±0.07 0.59±0.10 0.51±0.08＊＊ 1.13±0.15 0.64±0.03＊＊ 0.29±0.10＊＊IE2 0.00±0.00 0.56±0.10 0.81±0.15 0.88±0.06 0.00±0.00 0.30±0.09* 0.28±0.29＊＊ 0.01±0.01＊＊

3 討論

HCMV為一種雙鏈DNA病毒，具有嗜神經(jīng)性，是人類重要的致畸致神經(jīng)損傷病原體，也是發(fā)展中國(guó)家最常見(jiàn)的宮內(nèi)感染病原體，可通過(guò)胎盤傳播直接使胎兒感染進(jìn)而引起小頭畸形、認(rèn)知能力發(fā)育落后等異常［6-7］。目前，尚無(wú)任何獲得批準(zhǔn)的疫苗用于預(yù)防HCMV宮內(nèi)感染，也沒(méi)有任何獲得批準(zhǔn)的藥物用于治療妊娠期感染［8］。

黃芩素是中藥黃芩所含的主要黃酮之一，具有抗菌、抗病毒、抗炎、保肝、利膽、抗癌等作用，還能抗氧化、抗自由基損傷，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前有研究證實(shí)黃芩素在體外具有一定的抗流感病毒［9］的作用，以及抗HCMV和HSV-1的作用［10］，在人胚肺成纖維細(xì)胞中黃芩素抗HCMV的效果高于常用抗病毒藥物更昔洛韋［11］。HCMV作為一種嗜神經(jīng)病毒，可以感染多種神經(jīng)細(xì)胞，但以星形膠質(zhì)細(xì)胞最易感染，而有關(guān)黃芩素抑制HCMV感染人星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究目前還沒(méi)有報(bào)道。因此本研究采用星形膠質(zhì)細(xì)胞為模型，通過(guò)研究感染HCMV后病毒IE、pp65基因與蛋白水平的變化，探究黃芩素對(duì)HCMV在基因和蛋白水平的抑制作用。

已有研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞是HCMV感染的容納細(xì)胞［12-13］，本研究中AS感染HCMV后出現(xiàn)形態(tài)上明顯的細(xì)胞特征性病變效應(yīng)，基因和蛋白水平均有IE和pp65的表達(dá)，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)人星形膠質(zhì)細(xì)胞是HCMV的完全容納細(xì)胞。

本研究采用MTT法檢測(cè)藥物對(duì)AS細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示黃芩素在一定范圍內(nèi)能促進(jìn)人星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，不同濃度BAI+HCMV組的細(xì)胞活性均高于HCMV組，其中以20 μmol/L BAI+HCMV組的活性最高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以黃芩素濃度為20 μmol/L時(shí)進(jìn)行。目前文獻(xiàn)所提到的黃酮類藥物的抗病毒機(jī)制有兩種可能，一是抑制病毒的復(fù)制，二是影響病毒復(fù)制過(guò)程所必需的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［14］，已有研究證實(shí)黃芩素能抑制EGFR上酪氨酸激酶的活性［10，15］，而細(xì)胞表面的EGFR能與HCMV直接作用參與HCMV進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程［15］。在本研究中除對(duì)照組外其余各組的mRNA和蛋白水平均有IE和pp65的表達(dá)，其中BAI+HCMV組的IE和pp65表達(dá)量顯著低于HCMV組(P＜0.05)，但黃芩素對(duì)pp65的抑制效果顯著高于IE，提示黃芩素可能一方面影響病毒的進(jìn)入，另一方面影響IE蛋白對(duì)其后續(xù)蛋白的正常調(diào)控而抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

綜上所述，本研究用人星形膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)制HCMV感染模型，證明了黃芩素作為一種潛在抗病毒藥物對(duì)抑制HCMV感染具有良好的應(yīng)用前景，其抗HCMV感染可能是通過(guò)影響病毒的進(jìn)入，改變IE蛋白對(duì)后續(xù)蛋白的調(diào)控進(jìn)一步影響病毒復(fù)制階段而實(shí)現(xiàn)的，而黃芩素抗HCMV感染的機(jī)制還需進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

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