趙翠榮+余華強(qiáng)

摘要：小麥（Triticum aestivum L.）遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)單倍體技術(shù)能有效提高育種效率，縮短育種年限，創(chuàng)造新種質(zhì)和遺傳群體。20多年來(lái)的研究利用趨勢(shì)表明，玉米（Zea mays L.）染色體消失產(chǎn)生小麥單倍體是應(yīng)用最廣泛的方法，鴨茅狀摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.）染色體消失產(chǎn)生小麥單倍體也有應(yīng)用的潛力，但是都未做詳細(xì)的對(duì)比研究，至今尚未成為小麥育種的成熟技術(shù)手段，主要原因是在小麥單倍體胚的誘導(dǎo)、萌發(fā)以及染色體加倍等方面仍存在許多問(wèn)題，目前還達(dá)不到穩(wěn)定、高頻率生產(chǎn)小麥單倍體和雙單倍體的技術(shù)水平，導(dǎo)致與育種結(jié)合推廣應(yīng)用的速度很慢。

關(guān)鍵詞：小麥（Triticum aestivum L.）；玉米（Zea mays L.）；鴨茅狀摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.）；遠(yuǎn)緣雜交；染色體消失；單倍體胚；雙單倍體

中圖分類號(hào)：S512.1；S513；S334.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0008-05

Advances on Producing wheat Haploid and Doubled Haploid from Crosses of

Wheat×Maize and Wheat×Eastern Gamagrass

ZHAO Cui-rong，YU Hua-qiang

（Xiangyang Academy of Agricultural Science in Hubei Province， Xiangyang 441057， Hubei， China）

Abstract： The technology of producing wheat（Triticum aestivum L.） haploid by wheat distant hybridization can improve breeding efficiency， shorten breeding period and create new germplasm and genetic population. Research results during last 20 years suggested that producing haploid wheat by eliminating maize（Zea mays L.） chromosome was the widely used method，and eliminating eastern gamagrass（Tripsacum dactyloides L.） chromosome was the most potential way. But there is no detailed comparative studies of the two methods. There are problems in the process of wheat haploid embryo production， germination and the chromosome doubling. At present the two methods are still not so popular because of its low efficiency and unstability in producing wheat haploid and doubled haploid.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.）； maize（Zea mays L.）； eastern gamagrass（Tripsacum dactyloides L.）； wide cross； elimination of chromosome； haploid embryo； doubled haploid

收稿日期：2012-12-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-03-01A）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目；湖北省小麥工程技術(shù)研究中心建設(shè)項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：趙翠榮（1975-），女，湖北隨州人，副研究員，在讀碩士研究生，主要從事小麥生物技術(shù)育種研究，（電話）0710-3085380（電子信箱）

nkyzhaocr.2007@163.com。

國(guó)外20世紀(jì)70年代就有利用遠(yuǎn)緣雜交導(dǎo)致父本染色體消失從而誘導(dǎo)小麥（Triticum aestivum L.）單倍體的相關(guān)研究報(bào)道，20世紀(jì)80年代中后期以英國(guó)、法國(guó)、加拿大為代表的學(xué)者在利用玉米（Zea mays L.）誘導(dǎo)小麥單倍體領(lǐng)域的研究發(fā)展較快。多年來(lái)，應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)在法國(guó)、加拿大等國(guó)已經(jīng)育成一批高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種，目前已經(jīng)推廣應(yīng)用到歐洲和中東主要小麥產(chǎn)區(qū)；同時(shí)發(fā)展了一整套規(guī)?；某墒靻伪扼w育種技術(shù)體系，每年培育單倍體苗達(dá)到數(shù)以萬(wàn)計(jì)的規(guī)模。

在國(guó)內(nèi)，中國(guó)科學(xué)院和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院從20世紀(jì)90年代初開(kāi)始開(kāi)展了利用玉米或鴨茅狀摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.）花粉誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生單倍體的基礎(chǔ)研究，取得了一些有意義的研究結(jié)果，但是都未做詳細(xì)的對(duì)比研究，至今尚未成為小麥育種的成熟技術(shù)手段，直到2011年3月才首次出現(xiàn)了應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)育成小麥品種的報(bào)道[1]。究其原因，一是國(guó)內(nèi)缺乏規(guī)?；恼T導(dǎo)單倍體育種的成熟技術(shù)流程和規(guī)范，二是缺乏較長(zhǎng)季節(jié)進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交的條件和經(jīng)驗(yàn)，在單倍體胚的產(chǎn)生頻率和幼胚萌發(fā)方面效率太低，不能達(dá)到育種所需要的群體規(guī)模。

1 技術(shù)起源

隨著科學(xué)的發(fā)展，小麥族（Triticeae）遠(yuǎn)緣雜交在分類學(xué)上的界限日益被打破，過(guò)去認(rèn)為不可能雜交的種、屬，現(xiàn)在雜交獲得了成功。自1971年Lange[2]報(bào)道了利用栽培大麥（Hordeum vulgare L.，2n=2x=14）和球莖大麥（Hordeum bulbosum L.，2n=2x=14， 2n=4x=28）遠(yuǎn)緣雜交后父本的染色體消失可以產(chǎn)生大麥單倍體之后，1975年Barelay[3]首先報(bào)道了用普通小麥（2n=6x=42）和球莖大麥雜交后，父本染色體迅速消失，可以獲得小麥單倍體胚，但因小麥可交配性抑制基因Kr的限制導(dǎo)致了此法對(duì)小麥基因型具有選擇性，從而限制了此法的育種應(yīng)用。

1984年德國(guó)學(xué)者Zenkteler等[4]報(bào)道指出，禾本科早熟禾亞科（Pooideae）的普通小麥與黍亞科（Panicoideae）的玉米（2n=2x=20）遠(yuǎn)緣雜交可產(chǎn)生球形幼胚，但沒(méi)有細(xì)胞學(xué)證據(jù)，很多學(xué)者對(duì)這些持有懷疑態(tài)度。1986年英國(guó)學(xué)者Laurie等[5]發(fā)表了普通小麥與玉米遠(yuǎn)緣雜交可發(fā)生受精作用的細(xì)胞學(xué)證據(jù)，證明小麥與玉米雜交后，在最初的3次細(xì)胞分裂中，來(lái)自玉米花粉的染色體被逐漸完全排除掉，僅剩下21條母本小麥染色體的單倍體。進(jìn)一步利用小麥品種間代換系進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小麥×玉米的受精頻率不受Kr基因的影響[6，7]，即Kr基因在小麥×玉米中是不敏感的，為后來(lái)玉米法誘導(dǎo)小麥單倍體的育種應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

有學(xué)者先后發(fā)表了普通小麥與玉米[4，5]（2n=2x=20）、高粱（Sorghum bicolor，2n=20）[8]、珍珠粟（Pannisetum americanum，2n=14）[9]、類玉米（即大芻草，Zea mays ssp. Mexicana，2n=20）[10]、鴨茅狀摩擦禾（2n=4x=72）[11，12]雜交產(chǎn)生小麥單倍體的研究報(bào)告。這些雜交打破了以往小麥只能與一些小麥族族內(nèi)屬，如黑麥屬（Secale）、山羊草屬（Aegilops）、偃麥草屬（Elytrigia）、披堿草屬（Elymus）、大麥屬（Hordcum）及簇毛麥屬（Hynaldia）雜交的局限[13]，使分類距離相當(dāng)遠(yuǎn)的屬間雜交成為可能，這些研究強(qiáng)有力地推動(dòng)了遠(yuǎn)緣雜交理論和利用父本染色體消失產(chǎn)生單倍體技術(shù)研究的發(fā)展，并成為遠(yuǎn)緣雜交染色體消失法誘導(dǎo)小麥單倍體育種的最早記載。

2 研究進(jìn)展

近年來(lái)，國(guó)、內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)利用遠(yuǎn)緣雜交父本染色體消失產(chǎn)生單倍體的方法進(jìn)行了廣泛的研究，并取得了較大進(jìn)展，在利用玉米和鴨茅狀摩擦禾誘導(dǎo)小麥單倍體方面進(jìn)展也很快。

2.1 染色體消失法的細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)研究

Comeau等[14]用一種新設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)小麥與玉米雜交后0～4 d的胚珠，然后再?gòu)闹袆冇着哒?，所獲得的小麥單倍體中有1株的根尖中除21條小麥染色體外還含有l(wèi)條玉米染色體，但是在加倍的后代中丟失了。1991年王景林等[15]、1992年孫敬三等[12]、1993年陳綱等[16]、陳新民等[17]分別報(bào)道了利用普通小麥與玉米雜交產(chǎn)生小麥單倍體胚和苗，之后國(guó)內(nèi)一些單位也進(jìn)行了小麥與玉米雜交產(chǎn)生雙單倍體（Double haploid，DH）的技術(shù)研究，先后發(fā)表了普通小麥與玉米雜交產(chǎn)生小麥單倍體的階段性研究成果。1996年劉輝等[18]在小麥×玉米所獲得的DH后代蛋白質(zhì)電泳分析中，發(fā)現(xiàn)14.4%的DH株系出現(xiàn)玉米所特有的譜帶。1997年陳純賢等[19]用玉米特異的重復(fù)DNA序列為探針對(duì)來(lái)自小麥×玉米的2個(gè)小麥DH群體進(jìn)行RFLP分析，首次發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了異源玉米特異DNA片段的確在染色體消除過(guò)程中能以很低的頻率導(dǎo)入到小麥的DH后代中。2011年陳新民等[1]首次用玉米與小麥進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，并育成優(yōu)質(zhì)抗病小麥新品種中麥533。

1994年李大瑋等[20，21]最早報(bào)道了普通小麥與玉米族（Maydeae）摩擦禾屬（Tripsacum）的鴨茅狀摩擦禾雜交成功，并獲得了較普通小麥與玉米雜交更高的單倍體胚成胚率（2～3倍）。1999年邱紀(jì)文等[22]報(bào)道了在小麥×鴨茅狀摩擦禾雜交后代的分子檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)鴨茅狀摩擦禾DNA片段導(dǎo)入小麥基因組的證據(jù)。2000年李大瑋等[23]報(bào)道了普通小麥與鴨茅狀摩擦禾雜交可獲得比小麥與玉米雜交更高的受精率和成胚率，且雜交親和性不受小麥可交配性抑制基因Kr的控制[24]，提出小麥與鴨茅狀摩擦禾比小麥與玉米雜交更具優(yōu)越性的觀點(diǎn)。

2.2 染色體消失法的開(kāi)發(fā)利用研究

1988年Laurie等[25]提出了小麥與玉米雜交時(shí)，在玉米染色體消失前對(duì)雜合子進(jìn)行輻射處理，以期使玉米基因?qū)胄←湹脑O(shè)想，對(duì)于小麥種質(zhì)資源的創(chuàng)新、品種改良和遺傳研究等方面都具有重要意義。1996年歐陽(yáng)平等[13]提出：小麥與鴨茅狀摩擦禾雜交后，鴨茅狀摩擦禾的染色體在雜合子發(fā)育初期并未完全消失，而是以不同程度保留下來(lái)，不全是小麥單倍體，大部分為具有21～56條染色體數(shù)不等的非整倍體雜種，這對(duì)外源染色體或染色體片段向小麥導(dǎo)入是非常有利的；若鴨茅狀摩擦禾的染色體或染色體片段能夠通過(guò)與小麥染色體易位、交換或代換的方式導(dǎo)入小麥，將會(huì)打破小麥族內(nèi)雜交的局限性，加速小麥種質(zhì)材料的創(chuàng)新，為豐富小麥的遺傳背景做出貢獻(xiàn)。因?yàn)轼喢钅Σ梁坛哂幸话阋吧椭参锷L(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、抗病、抗蟲、耐旱、耐寒、耐瘠薄等特性[20，21，26]外，還具有C4類型植物高光效及其獨(dú)有的兼性無(wú)融合生殖特性，對(duì)小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用方面具有積極意義。

2.3 誘導(dǎo)小麥單倍體的成效對(duì)比研究

李大瑋等[20，21，23]提出鴨茅狀摩擦禾為野生型、多年生，在很多北方地區(qū)可戶外越冬，有助于克服小麥×玉米中每年在溫室播種玉米難以控制花期的困難，它穗多且大，花期長(zhǎng)，花粉多，可較長(zhǎng)時(shí)間提供大量花粉，鴨茅狀摩擦禾誘導(dǎo)得胚率是玉米誘導(dǎo)的2～3倍，但存在較多的非整倍體，從外源基因?qū)氲慕嵌日J(rèn)為小麥×鴨茅狀摩擦禾比小麥×玉米更具優(yōu)越性；而2003年范金萍等[27]的研究表明玉米作為花粉供體植物是當(dāng)時(shí)產(chǎn)生小麥單倍體最成功的方法。

2.4 主要技術(shù)環(huán)節(jié)

比較幾十年來(lái)公開(kāi)發(fā)表的關(guān)于該項(xiàng)技術(shù)的學(xué)術(shù)論文和研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，其技術(shù)環(huán)節(jié)的研究?jī)?nèi)容主要包括：雙親花期相遇的調(diào)節(jié)技術(shù)，小麥基因型對(duì)得胚率的影響，不同基因型玉米與摩擦禾對(duì)小麥得胚率的影響，不同雜交技術(shù)對(duì)得胚率的影響，不同激素種類、不同激素處理濃度配比對(duì)得胚率的影響，不同培養(yǎng)基對(duì)胚萌發(fā)的影響，不同加倍處理方法對(duì)加倍效果的影響，單倍體與雙單倍體的區(qū)別與鑒別方法。

2.4.1 雙親花期調(diào)節(jié)技術(shù) 雙親花期調(diào)節(jié)技術(shù)的研制成功是誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生單倍體的必要和首要條件。除胡冬梅[28]、蔡華等[29]、顧堅(jiān)等[30]的試驗(yàn)有提及外，此項(xiàng)技術(shù)關(guān)于花期調(diào)節(jié)方面鮮有報(bào)道。

2.4.2 影響成胚因素方面的研究 從授粉到單倍體胚的形成和發(fā)育，影響因素很多，綜合來(lái)看主要包括：不同玉米與鴨茅狀摩擦禾基因型，不同國(guó)家、不同地域、不同生態(tài)習(xí)性、不同組合的不同小麥基因型（太谷核不育基因、Kr基因的影響也有研究），授粉或激素處理的時(shí)機(jī)、濃度與方法，環(huán)境溫度、濕度、光照等。

2.4.3 胚萌發(fā)的影響因素 誘導(dǎo)形成的單倍體胚在植株生長(zhǎng)到一定的時(shí)期后取回室內(nèi)進(jìn)行消毒處理和無(wú)菌接種，在人為創(chuàng)造的營(yíng)養(yǎng)條件和光照、溫度、濕度條件下無(wú)菌生長(zhǎng)萌發(fā)成苗。其萌發(fā)比例受很多因素的影響，如培養(yǎng)基成分、光照時(shí)間、光照度、光質(zhì)、溫度與變溫處理、濕度控制等。

2.4.4 單倍體植株的移栽 室內(nèi)胚無(wú)菌萌發(fā)成苗后長(zhǎng)到2～3葉時(shí)可以移栽。要保證移栽成活，培育壯苗是關(guān)鍵，同時(shí)保證逐步過(guò)渡和適應(yīng)外部條件也是關(guān)鍵。

顧堅(jiān)等[30]的試驗(yàn)結(jié)果表明，單倍體胚培養(yǎng)的幼苗在昆明市不需越夏，5月中旬至6月中旬雜交獲得的單倍體苗移栽加倍后一般可于當(dāng)年9～11月收獲加倍單倍體種子。范金萍等[27]在冬季把試管苗移栽至不加溫的溫室中，保持較高的濕度，取得了94.3%的移栽成活率和95.7%的加倍率。周傳恩等[31]認(rèn)為移植根系不發(fā)達(dá)的再生植株可以加0.5 μmol/L萘乙酸（NAA）促進(jìn)根系生長(zhǎng)。王成社等[32]指出，在壯苗培養(yǎng)基中添加一定濃度的多效唑（MET）可提高小麥花培試管綠苗的移栽成活率。秦靜遠(yuǎn)等[33]、白延紅[34]報(bào)道，在16 ℃低溫條件下，在壯苗培養(yǎng)基中添加2～3 mg/L的MET不僅可以使花粉植株生長(zhǎng)健壯，安全越夏，而且可以大幅度提高移栽成活率。來(lái)長(zhǎng)凱[35]認(rèn)為小麥單倍體幼苗移栽（從培養(yǎng)基中移栽到土壤中）應(yīng)遵循逐漸過(guò)渡的原則。

2.4.5 單倍體植株加倍 單倍體植株的成功加倍是育種應(yīng)用的前提。

1）試劑的選擇。到目前為止，秋水仙素仍然是誘導(dǎo)植物體細(xì)胞染色體加倍的最有效的化學(xué)誘變劑之一。秋水仙素是微管特異性藥物，由于適宜濃度的秋水仙素能破壞或抑制紡錘絲的形成，可使分生細(xì)胞復(fù)制的染色體在細(xì)胞分裂時(shí)不能分向兩極，從而導(dǎo)致新生細(xì)胞的染色體加倍[36]。二甲基亞砜（DMSO）能夠提高植物組織的滲透性，使藥物容易進(jìn)入植物細(xì)胞[37]。紀(jì)鳳高等[38]、Wang等[39]在誘導(dǎo)小麥多倍體時(shí)，發(fā)現(xiàn)DMSO不僅能促進(jìn)秋水仙素快速浸透到植物組織中，并能顯著提高秋水仙素的加倍效果。

2）試劑濃度與加倍方法。加倍方法可采用浸根、直接加入培養(yǎng)基中、注射分蘗節(jié)等方法，通常采用秋水仙素浸根處理。國(guó)外常用高濃度（1 000 mg/L）、高溫度（20～25 ℃）、短時(shí)間（5 h）處理，而國(guó)內(nèi)常采用低濃度（400～500 mg/L）、低溫度（10～15 ℃）、長(zhǎng)時(shí)間（1～3 d）處理。

3） 加倍后的移栽環(huán)境控制。傅杰等[40]、王培等[41]對(duì)花粉植株的染色體加倍采用覆蓋塑料薄膜保濕和適時(shí)加倍等簡(jiǎn)單措施取得了很好的移栽和加倍效果。范金萍等[27]認(rèn)為加倍后移栽保持較高的濕度有利于成活。

2.4.6 倍性檢測(cè)方法研究 植株倍性檢測(cè)的方法很多，有直接形態(tài)學(xué)鑒定、花藥育性形態(tài)學(xué)觀察、結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度檢測(cè)、根尖染色體數(shù)壓片檢測(cè)、同工酶分析等多種方法[42]。最簡(jiǎn)單直觀的鑒定方法是看是否結(jié)實(shí)，因?yàn)槲醇颖冻晒Φ膯伪扼w植株是不結(jié)實(shí)的。秦余香等[43]指出鑒定花粉植株倍性通常采用壓片法觀察染色體。但是這種方法程序繁瑣且工作量大。用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度來(lái)鑒定花粉植株倍性的方法簡(jiǎn)便快速，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠。杜麗璞等[44]的試驗(yàn)表明，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度受染色體倍性控制；單倍體與二倍體之間氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度差異非常顯著，單倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度一般在60 μm以下，二倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度一般在70 μm以上。有研究認(rèn)為，由于氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度受測(cè)試葉片取樣部位的影響，所以從同一部位取樣為宜，這樣可以減少取樣誤差，提高準(zhǔn)確性[45]。另外，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定也是一種快速檢測(cè)染色體倍性的方法。

3 存在的問(wèn)題

小麥遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)單倍體技術(shù)能有效提高育種效率，縮短育種年限。國(guó)內(nèi)20多年來(lái)的研究利用趨勢(shì)表明，玉米染色體消失產(chǎn)生小麥單倍體是最有效的方法，鴨茅狀摩擦禾染色體消失產(chǎn)生小麥單倍體也有應(yīng)用的潛力，但玉米在染色體消失法誘導(dǎo)小麥單倍體過(guò)程中的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了鴨茅狀摩擦禾的應(yīng)用，筆者分析認(rèn)為，小麥和鴨茅狀摩擦禾雜交產(chǎn)生了較多的非整倍體，可能是鴨茅狀摩擦禾在誘導(dǎo)單倍體方面的限制因素。

自20世紀(jì)90年代初我國(guó)開(kāi)展染色體消除法誘導(dǎo)小麥單倍體技術(shù)研究以來(lái)，許多研究者對(duì)利用玉米或鴨茅狀摩擦禾誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生單倍體這兩種獲得小麥單倍體的方法進(jìn)行了深入的研究，進(jìn)展很快，但在小麥單倍體胚的誘導(dǎo)、單倍體胚的萌發(fā)以及染色體的加倍等方面仍存在許多問(wèn)題，目前還達(dá)不到穩(wěn)定、高頻率生產(chǎn)小麥單倍體和雙單倍體的技術(shù)水平，導(dǎo)致與育種結(jié)合推廣應(yīng)用的速度很慢。其原因一是遠(yuǎn)緣雜交后染色體消除法誘導(dǎo)小麥單倍體技術(shù)是一個(gè)多步驟、多方法、多因素影響的綜合性強(qiáng)、協(xié)調(diào)性要求嚴(yán)格的系統(tǒng)工程，中間環(huán)節(jié)很多。從花期調(diào)節(jié)到整穗授粉、激素處理、胚搶救、胚培養(yǎng)、單倍體苗越夏、移栽、染色體加倍、倍性檢測(cè)等諸多環(huán)節(jié)，既需有田間育種試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)又需有室內(nèi)無(wú)菌培養(yǎng)條件和技術(shù)，還涉及到溫室與大棚中玉米的栽培、細(xì)胞學(xué)方面的一些綜合知識(shí)和實(shí)際技能，需要一定的經(jīng)驗(yàn)積累才能建立起全套技術(shù)規(guī)范。二是影響最終DH系獲得頻率的因素很多，綜合來(lái)看染色體消除法誘導(dǎo)小麥單倍體的得胚率普遍較低，尚沒(méi)有形成穩(wěn)定的得胚率和育種所需的DH群體規(guī)模。因此在確保適宜小麥開(kāi)花結(jié)實(shí)期有充足的父本花粉源的前提下，應(yīng)從提高得胚率、綠苗分化率、移栽成活率、染色體加倍率等諸多方面共同促成高效育種體系的建立。

致謝：感謝李宏潮研究員、陳新民研究員對(duì)本研究的悉心指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯 昌炎新）

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（責(zé)任編輯 昌炎新）