譚力銘 ,仇成鳳 ,李 峰 ,劉 洪 ,羅順紅 ,鄧紫薇 ,王宏強(qiáng) ,雷禮輝

(1.懷化市第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)研究室,湖南懷化418000;2.懷化市第一人民醫(yī)院骨科)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthristis,OA)是一種嚴(yán)重危害中老年人健康的慢性退變性關(guān)節(jié)疾病。其致病因素非常復(fù)雜,被認(rèn)為是年齡、遺傳、機(jī)械損傷、生物等多種因素導(dǎo)致的一種長(zhǎng)期、慢性、漸進(jìn)的病理過程,其中,關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變是OA發(fā)病的病理基礎(chǔ)和核心[1-2]。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成,幾乎所有的致病因素均是通過影響這二者而致病[3-5]?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)通過降解細(xì)胞外基質(zhì)而啟動(dòng)了OA的早期病變過程[6],因此,被認(rèn)為是OA致病因素中的一類關(guān)鍵介質(zhì),其中MMP-13,又稱膠原酶-3,是唯一能夠裂解膠原分子中三維螺旋的酶,主要降解占細(xì)胞外基質(zhì)95%的Ⅱ型膠原。MMP-13具有5個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域,以酶原形式分泌,受蛋白酶或其它因子激活,其催化活動(dòng)區(qū)有Zn2+結(jié)合位點(diǎn),是一個(gè)Zn2+、Ca2+依賴的蛋白水解酶[7-9]。本研究通過改良Hult法[10]建立SD大鼠OA模型,探討給予不同劑量的鋅對(duì)OA軟骨的作用及對(duì)MMP-13表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與模型復(fù)制

健康雄性SD大鼠64只,由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,批號(hào) SCXK(湘)2010-0004,體質(zhì)量180±10 g,隨機(jī)分為對(duì)照組、低鋅組、中鋅組和高鋅組4組。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后,行改良Hulth法復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎模型:手術(shù)前肌肉注射青霉素40萬U/只,切斷右膝關(guān)節(jié)前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板,止血并關(guān)閉傷口,肌肉注射青霉素40萬U/只。術(shù)后不固定患肢,置于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)籠中允許其自由活動(dòng)及進(jìn)食;驅(qū)趕強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)1周,每周上午與下午各15 min。

1.2 給藥方法

行造模術(shù)后第2天,每只大鼠按體質(zhì)量灌胃給藥,2次/天,低鋅組給予硫酸鋅每天5 mg/kg,中鋅組每天10 mg/kg,高鋅組每天20 mg/kg,對(duì)照組給予等劑量生理鹽水灌胃。分別于術(shù)后4周、8周分組處理,每次每組8只。

1.3 標(biāo)本采集和處理

每只動(dòng)物行深度麻醉處死后,立即解剖右膝關(guān)節(jié),分離周圍組織,暴露右膝股骨內(nèi)側(cè)髁,切下股骨髁置于4%多聚甲醛中固定,15%EDTA-2Na溶液脫鈣,石蠟包埋,分別切片,行HE染色、MMP-13免疫組化染色。

1.4 HE染色

石蠟切片5 μm脫蠟后染色,蘇木素染色3 min,水洗,0.5%鹽酸酒精分化30 s,水洗,伊紅染色1 min,再水洗,快速過梯度酒精脫水,晾干后中性樹膠封片。細(xì)胞核藍(lán)紫色,胞漿、間質(zhì)紅色(蘇木素-伊紅染色液,XW-RS-001,上海滬峰生物科技有限公司)。

1.5 免疫組織化學(xué)

石蠟切片3 μm連續(xù)切片;60℃ ～65℃烤片4 h;進(jìn)行脫蠟、水化,采用高壓抗原修復(fù)方式對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù);每張切片加50 μL過氧化物酶阻斷液,室溫下孵育10 min;每張切片加50 μL非免疫性動(dòng)物血清,室溫下孵育10 min;甩去血清,每張切片加50 μL第一抗體(MMP13,兔抗 ab39012稀釋度1∶200),4℃過夜;按照免疫組化試劑盒(KIT-0305,羊抗鼠/兔,邁新生物)操作;每張切片加1～2滴新鮮配制的DAB(DAB顯色試劑,產(chǎn)品編號(hào)Cat.No:DAB-0031/1031),顯微鏡下觀察3～10 min,陽性顯色為棕色或黃色;蘇木素復(fù)染,切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥,中性樹膠封固。胞膜、胞漿、胞核染色,為棕色信號(hào)。

1.6 觀察指標(biāo)

光鏡下對(duì)HE染色標(biāo)本行組織形態(tài)學(xué)觀察;應(yīng)用雙盲法參照Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11](見表1)對(duì)HE切片進(jìn)行評(píng)分;術(shù)后8周MMP-13免疫組化染色切片用Motic Fluo 1.0測(cè)定其灰度值進(jìn)行半定量分析。

表1 骨性關(guān)節(jié)炎組織病理學(xué)分級(jí)評(píng)分Mankin表(總分14分)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。全部數(shù)據(jù)以用±s表示,one-way ANOVA方法對(duì)組間差異進(jìn)行比較,P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察

從圖1可見,術(shù)后4周,對(duì)照組健側(cè)大部分為正常關(guān)節(jié)軟骨組織,HE染色基質(zhì)著色均勻,無失染;軟骨細(xì)胞核呈深藍(lán)色,細(xì)胞層次清楚,排列整齊,大小均一。其余4組(對(duì)照組術(shù)側(cè)、低鋅組術(shù)側(cè)、中鋅組術(shù)側(cè)和高鋅組術(shù)側(cè))軟骨損傷均出現(xiàn)輕度損傷,軟骨表層不平整,無裂隙,細(xì)胞數(shù)或增多,或稍減少,基質(zhì)染色輕度減少;基質(zhì)染色輕染,有不均現(xiàn)象,但4組之間的軟骨損傷程度無明顯差異。

術(shù)后8周,對(duì)照組健側(cè)與術(shù)后4周時(shí)沒有區(qū)別,均為正常軟骨組織。對(duì)照組術(shù)側(cè)、低鋅組術(shù)側(cè)和中鋅組術(shù)側(cè)的軟骨損傷程度較術(shù)后4周時(shí)加重,為中度軟骨損傷,軟骨表面不規(guī)則,有些出現(xiàn)裂隙,細(xì)胞排列紊亂;簇集軟骨細(xì)胞出現(xiàn)頻率增加,或細(xì)胞數(shù)減少;基質(zhì)染色不均甚至出現(xiàn)重度減少;潮線不規(guī)則,潮線完整性受到破壞。高鋅組術(shù)側(cè)軟骨組織為輕度軟骨損傷,無裂隙出現(xiàn),軟骨細(xì)胞數(shù)稍減少,基質(zhì)染色輕染。

圖1 關(guān)節(jié)軟骨HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察(×200)

2.2 HE切片Mankin評(píng)分

從表2可見,術(shù)后對(duì)照組4周和8周Mankin評(píng)分術(shù)側(cè)明顯高于健側(cè)(P＜0.05),術(shù)手8周,高鋅組術(shù)側(cè)Mankin評(píng)分明顯低于對(duì)照組術(shù)側(cè)(P＜0.05)。

表2 各組標(biāo)本Mankin評(píng)分結(jié)果

2.3 關(guān)節(jié)軟骨MMP-13免疫組化觀察

從圖2和圖3可見,對(duì)照組健側(cè)的標(biāo)本中MMP-13的含量較少,對(duì)照組術(shù)側(cè)、低鋅組術(shù)側(cè)和中鋅組術(shù)側(cè)3組中的MMP-13含量較多,免疫組化切片中可見大量染成棕褐色的陽性細(xì)胞,高鋅組術(shù)側(cè)標(biāo)本中的MMP-13含量較對(duì)照組術(shù)側(cè)少,兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

本研究以雄性適齡SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,采用改良Hulth法復(fù)制OA模型。改良Hulth法與傳統(tǒng)Hulth法比較,具有出血少、術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)輕、對(duì)實(shí)驗(yàn)過程影響小等優(yōu)點(diǎn)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),雄性SD大鼠較之于雌性SD大鼠更適合復(fù)制OA模型,雄性SD大鼠具有抗感染強(qiáng)、對(duì)麻醉藥品的耐受性穩(wěn)定、術(shù)后存活率高等優(yōu)點(diǎn),而且與利用新西蘭大白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較,其成本低,喂養(yǎng)方便。因此,雄性SD大鼠是較為理想的一種復(fù)制OA模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

圖2 術(shù)后8周各組MMP-13免疫組化結(jié)果(×400)

圖3 術(shù)后8周各組MMP-13免疫組化灰度圖 與對(duì)照組健側(cè)比較,#:P＜0.05;與對(duì)照組術(shù)側(cè)比較,*:P＜0.05

鋅是體內(nèi)一種重要的微量元素,參與機(jī)體多種生物化學(xué)反應(yīng),其具有調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)傷口愈合、維護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定以及抗氧化等作用。鋅用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)早有研究并已在臨床上使用[12-13]。OA的發(fā)病機(jī)制雖然不同于RA,但其具有共同的病理改變?nèi)缁ぱ装Y及軟骨破壞。同時(shí),引起OA軟骨組織細(xì)胞外基質(zhì)主要成分Ⅱ型膠原降解的重要酶MMP-13,是一種鋅離子依賴的水解酶。本研究通過SD大鼠整體動(dòng)物模型探討鋅對(duì)OA軟骨的作用及對(duì)MMP-13表達(dá)的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在造模術(shù)后第2天,除對(duì)照組外,其它各組分組分別給予不同劑量的鋅干預(yù)后4周,取膝關(guān)節(jié)軟骨組織行HE染色光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化并Mankin評(píng)分,結(jié)果顯示造模成功。低鋅組術(shù)側(cè)、中鋅組術(shù)側(cè)與高鋅組術(shù)側(cè)與對(duì)照組術(shù)側(cè)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明在給予鋅4周后,鋅對(duì)OA軟骨作用不明顯。在繼續(xù)分組給藥干預(yù)后8周發(fā)現(xiàn),高鋅組術(shù)側(cè)與對(duì)照組術(shù)側(cè)比較,光鏡下HE染色切片觀察,高鋅組術(shù)側(cè)的標(biāo)本軟骨組織損傷輕于對(duì)照組術(shù)側(cè),兩組Mankin評(píng)分結(jié)果比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;MMP-13免疫組化切片比較,高鋅組術(shù)側(cè)標(biāo)本中MMP-13陽性細(xì)胞數(shù)少,其灰度值低,兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而低鋅組、中低組與對(duì)照組術(shù)側(cè)比較,其軟骨損傷未有明顯差異,Mankin評(píng)分與MMP-13免疫組化切片灰度值比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上研究表明,高劑量鋅(每天20 mg/kg)連續(xù)給予8周后,可以明顯減輕SD大鼠OA軟骨損傷,可以減少M(fèi)MP-13的表達(dá)。

早期研究與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鋅對(duì)OA軟骨的作用不是單一的。王聲雨等[14]對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中16種元素分析發(fā)現(xiàn),骨性關(guān)節(jié)炎組滑膜組織中的Zn2+含量較正常組升高。MMPs包括MMP-13是OA病變發(fā)生發(fā)展過程中重要的蛋白酶家族,因其需要Zn2+等輔助因子而得名,其催化活性區(qū)有鋅離子結(jié)合位點(diǎn),對(duì)酶的催化作用至關(guān)重要。因此,在沒有體外鋅干預(yù)的情況下,骨性關(guān)節(jié)炎組滑膜組織中的Zn2+含量要高于正常的關(guān)節(jié)滑膜組織可能與MMP-13的活化需要鋅有關(guān)。本研究在分別給予不同劑量、不同時(shí)間的鋅治療后,發(fā)現(xiàn)高劑量連續(xù)治療8周后,可以明顯減輕OA軟骨損傷,且減少M(fèi)MP-13的表達(dá),這些表明,鋅是通過多種途徑作用OA軟骨,其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明,在接下來的實(shí)驗(yàn)中,進(jìn)一步探明高劑量鋅對(duì)OA軟骨的保護(hù)機(jī)制將是我們的研究重點(diǎn)。

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