王琳，李福年，柳曉義，姜丹丹，呂志棟，曲慧利

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院乳腺外科，山東 青島 266003)

基因治療是治愈腫瘤的重要舉措之一，大量基礎研究已取得許多重要成果并顯示出良好的應用前景，但如何找到高效性、特異性、靶向性的治療基因載體一直是基礎與臨床研究的熱點。近年來研究顯示，骨髓源性間充質(zhì)干細胞(MSCs)對腫瘤組織具有趨化特性，能被轉(zhuǎn)染表達外源基因，同時保持自身生物學穩(wěn)定性，是一高靶向性基因治療的有效運載工具[1-2]。因骨髓源性MSCs數(shù)量有限，增生、分化能力隨著年齡增長而明顯下降，限制了其廣泛應用。相對于骨髓源性MSCs，人臍帶MSCs(hUMSCs)則無上述缺憾。IL-18是新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，能通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。本文擬從人臍帶組織分離hUMSCs，將攜帶IL-18基因的慢病毒轉(zhuǎn)染該細胞，制備一種能穩(wěn)定表達IL-18的hUMSCs，為乳癌基因治療提供一種有效的實驗工具。

1 材料和方法

1.1 標本和試劑

臍帶取自我院產(chǎn)科健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦，經(jīng)產(chǎn)婦及家屬授權(quán)同意；攜帶IL-18基因的慢病毒和攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建；RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司；兔抗人IL-18抗體(ab68435)購自美國Abcam公司；抗GAPDH抗體及HRP標記的IgG購自北京康為世紀生物科技公司；小鼠抗人PE或FITC標記的單抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD105購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640及DMEM低糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)等購自美國HyClone公司。

1.2 方法

1.2.1hUMSCs的體外分離、培養(yǎng)方法和形態(tài)學觀察 無菌采集足月健康胎兒臍帶4～5 cm，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復充分洗滌，用注射器沖去臍靜脈及動脈內(nèi)的殘留血液，分離并去除臍帶外膜組織和血管組織，即可獲得臍帶Wharton膠組織，將其剪碎成1～2 mm3組織塊，移至質(zhì)量分數(shù)為0.001的膠原酶Ⅳ中，37 ℃消化18 h，定時搖動，過100目篩網(wǎng)，收集含細胞的濾液，室溫下以1 200 r/min離心10 min，棄上清液，保留沉淀；用PBS洗滌2次后，以1×109/L的細胞密度接種于T25塑料培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的飽和濕度環(huán)境下，于含體積分數(shù)為0.10 FBS的DMEM-LG中培養(yǎng)。6～7 d后首次全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3～4 d換液1次。觀察細胞達80%融合后，用胰酶消化1～5 min，在顯微鏡下控制消化時間，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。取生長良好的第3代hUMSCs用于實驗。

1.2.2hUMSCs表面標志的檢測 第3代細胞長到90%融合時，胰酶37 ℃消化1～5 min，調(diào)整細胞密度至(1～2)×109/L，使用PBS洗滌3次，加入1 mL預冷的體積分數(shù)為0.70的乙醇，充分吹打制成單細胞懸液，4 ℃冰箱中固定24 h后，離心，棄去上清液，分別加入小鼠抗人PE或FITC標記的單抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD105及同型對照，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌后用多聚甲醛重懸，流式細胞儀分析。

1.2.3攜帶IL-18基因的慢病毒轉(zhuǎn)染hUMSCs 將hUMSCs細胞按每孔1×104接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加100 μL培養(yǎng)基。12～20 h后感染病毒，根據(jù)感染復數(shù)(MOI)加入相應量的病毒。加polybrene，24 h后換培養(yǎng)液。共設3個組：實驗組轉(zhuǎn)染慢病毒，對照組轉(zhuǎn)染空白慢病毒，空白對照組未進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察各組綠色熒光蛋白的表達，分析感染效率，選擇最佳感染條件。

1.2.4RT-PCR法檢測IL-18-hUMSCs的mRNA表達 轉(zhuǎn)染5 d后采用Trizol試劑提取3組細胞總RNA，IL-18基因上游引物序列為：5′-GAATAAAG-ATGGCTGCTGAACC-3′，下游引物為：5′-CCTGG-GACACTTCTCTGAAA-3′，擴增片段長439 bp；以GAPDH作為內(nèi)參照，擴增片段長146 bp。進行RT-PCR反應，反應條件：95 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，35個循環(huán)。取擴增后產(chǎn)物于20 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳分析，與對照組和空白對照組進行比較。

1.2.5Western方法檢測IL-18-hUMSCs的蛋白表達情況 每組收集1×106個細胞，裂解后離心，上清液作為樣本，95 ℃水浴變性10 min，離心，取上清液，-20 ℃冰箱保存。進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉后加入兔抗人IL-18抗體(Abcam，1∶1 000)及抗GAPDH抗體，4 ℃反應過夜。第2天洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(北京康為世紀公司生產(chǎn)，1∶8 000)，室溫孵育1 h，化學發(fā)光法檢測目的蛋白質(zhì)的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 hUMSCs分離培養(yǎng)和鑒定

體外分離的hUMSCs貼壁生長，呈長梭形，以分散的克隆集落形式增殖(圖1a)。攜帶IL-18基因慢病毒表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，hUMSCs細胞形態(tài)未見明顯變化，仍為長梭形(圖1b、c)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，CD29、CD44和CD105為(+)，CD34和CD45為(-)，符合hUMSCs的表型(圖2)。

2.2 轉(zhuǎn)染IL-18的hUMSCs的鑒定

感染時將病毒按不同MOI值加入hUMSCs細胞中。結(jié)果顯示，hUMSCs細胞在MOI為70、50、30、10時的感染率分別為95%、80%、55%、25%(圖3)。MOI值越高，綠色熒光強度越強，MOI為50、30、10時均未見明顯的細胞毒性，但MOI為70時hUMSCs細胞形態(tài)欠佳。因此，本研究確定最佳感染條件MOI為50。

2.3 IL-18 mRNA的表達

以GAPDH(長為142 bp)為內(nèi)參照，實驗組在435 bp處可見一特異性條帶，其IL-18 mRNA的相對表達量為1.38±0.34；而對照組和空白對照組則未見此條帶，其IL-18 mRNA的相對表達量分別為0.48±0.18、0.73±0.29。兩對照組間IL-18 mRNA相對表達量比較差異無顯著性(P>0.05)；與兩對照組比較，實驗組IL-18 mRNA相對表達量明顯增高，差異有顯著性(F=27.54，P<0.05)。見圖4。

2.4 IL-18蛋白表達情況

在轉(zhuǎn)染后5 d，實驗組中IL-18蛋白的相對表達量為1.46±0.42，而對照組和空白對照組相對表達量分別為0.59±0.25、0.53±0.36。兩對照組間IL-18蛋白相對表達量比較差異無顯著性(P>0.05)；與兩對照組比較，實驗組IL-18蛋白相對表達量明顯增高，差異均有顯著意義(F=31.22，P<0.05)。見圖5。

a：第3代hUMSCs細胞(普通光，100倍)；b：感染5 d時hUMSCs細胞(普通光，200倍)；c：感染5 d時hUMSCs細胞(熒光，200倍)。

圖2 流式細胞儀鑒定人臍帶間充質(zhì)干細胞表型特征

MOI值：A=70，B=50，C=30，D=10。100倍。

M:標準參照物，①實驗組，②對照組，③空白對照組。

A：GAPDH，B：IL-18。

3 討 論

目前，常用腫瘤的基因治療載體主要有病毒載體和非病毒栽體兩類，病毒性載體的優(yōu)點是轉(zhuǎn)染效率高，但受免疫原性、細胞毒作用、攜帶外源基因的大小受限和病毒滴度不易提高等問題困擾，其研究和應用受到一定限制；非病毒性載體的優(yōu)點就是安全、制備簡單及攜帶外源性基因的容量巨大，但其轉(zhuǎn)染效率較低、基因表達時間較短也影響其應用[4]。如何建立安全有效的治療基因?qū)胂到y(tǒng)成為研究者們首要解決的問題。

MSCs是一種多能干細胞，具有自我更新和多向分化的潛能，同時具有增殖能力強、向腫瘤遷移等重要的生物學特性，該細胞能被高效轉(zhuǎn)染并表達外源性目的基因，且不因轉(zhuǎn)染外源基因而致改變。尤其MSCs的趨化追蹤能力，可使其遷移至無法實施手術(shù)切除甚至影像學無法發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，通過表達抗腫瘤分子清除轉(zhuǎn)移灶，進而降低腫瘤復發(fā)的概率，特別是對轉(zhuǎn)移性較強的腫瘤具有重要治療價值，在腫瘤基因治療領域具有廣闊的應用前景[5-6]。目前研究表明，骨髓來源MSCs的應用具有一定局限性，隨著明顯減少的干細胞數(shù)量、老化的年齡和下降的增殖分化能力，骨髓量也有提取限制，取材時對病人也有損傷，而且移植給異體有發(fā)生免疫反應的風險。更原始、更低的免疫原性使hUMSCs一般不引起免疫反應。其優(yōu)點還有：從產(chǎn)婦嬰兒身上取材方便且安全性高，沒有道德、倫理學的限制，以及感染及傳播潛伏性病毒和病原微生物概率較低等[7]。

IL-18是一多效性細胞因子，具有誘導γ干擾素產(chǎn)生、增強自然殺傷細胞和毒性T淋巴細胞活性、誘導輔助T細胞等多種生物學功能。它能通過激活T細胞和巨噬細胞來誘導癌細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成，并且能與其他因子協(xié)同抗腫瘤或直接殺滅腫瘤細胞，發(fā)揮強大的抗腫瘤作用[8]。

本研究從人臍帶組織中成功分離出hUMSCs，將攜帶IL-18基因的慢病毒轉(zhuǎn)染至hUMSCs，構(gòu)建的IL-18-hUMSCs培養(yǎng)后穩(wěn)定表達IL-18 mRNA和蛋白，表明hUMSCs作為IL-18的有效運載工具是切實可行的。IL-18-hUMSCs既能發(fā)揮MSCs的靶向腫瘤部位的特性，又能發(fā)揮IL-18抗腫瘤效應，可作為腫瘤靶向基因治療新選擇。

[參考文獻]

[1] EGGENHOFER E, STEINMANN J F, RENNER P, et al. Mesenchymal stem cells together with mycophenolate mofetil inhibit antigen presenting cell and T cell infiltration into allogeneic heart grafts[J]. Transpl Immunol, 2011,24(3):157-163.

[2] TIAN L L, YUE W, ZHU F, et al. Human mesenchymal stem cells play a dual role on tumor cell growth in vitro and in vivo[J]. J Cell Physiol, 2011,226(7):1860-1867.

[3] WONG J L, MUTHUSWAMY R, BARTLETT D L, et al. IL-18-based combinatorial adjuvants promote the intranodal production of CCL19 by NK cells and dendritic cells of cancer patients[J]. Oncoimmunology, 2013,2(9): e26245.

[4] 余佳澤,吳敬波. 腫瘤基因治療載體的選擇及使用安全性的研究進展[J]. 西南軍醫(yī), 2010,12(3):511-513.

[5] LING X, MARINI F, KONOPLEVA M, et al. Mesenchymal stem cells overexpressing IFN-β inhibit breast cancer growth and metastases through Stat3 signaling in a syngeneic tumor model[J]. Cancer Microenviron, 2010,3(1):83-95.

[6] 胡全君,張良. 脂肪間充質(zhì)干細胞及其在肝臟組織工程中的應用前景[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2010,25(3):280-282.

[7] ARIEN-ZAKAY H, LECHT S, NAGLER A, et al. Neuroprotection by human umbilical cord blood-derived progenitors in ischemic brain injuries[J]. Arch Ital Biol, 2011,149(2):233-245.

[8] SUGIE T, MURATA-HIRAI K, IWASAKI M, et al. Zoledronic acid-induced expansion of γ δ T cells from early-stage breast cancer patients: effect of IL-18 on helper NK cells[J]. Cancer Immunol Immunother, 2013,62(4):677-687.