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(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室,重慶 400716; 2. 家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室,重慶 400716)

蠶蛹含有豐富的蛋白質(zhì),干蠶蛹中蛋白質(zhì)含量高達(dá)45% ～ 55%,其中人體必需的8種氨基酸占總氨基酸的40%左右,是人類理想的蛋白質(zhì)來源[1]。但繅絲蠶蛹有很重、很難除盡的腥味,不能被消費者直接接受;其次,蠶蛹蛋白的水溶性較差,不利于在生產(chǎn)中應(yīng)用;再次,由于蠶蛹中存在約30ku的大分子蛋白,會引起部分人出現(xiàn)過敏反應(yīng),據(jù)估計,中國每年大約有1000人因食用蠶蛹蛋白而過敏,甚至出現(xiàn)休克癥狀[2]。因此,有必要對繅絲蠶蛹進(jìn)行酶解,制備生物活性肽,提高繅絲蠶蛹蛋白的利用價值。

人類的衰老現(xiàn)象及許多慢性疾病都和人體內(nèi)的自由基水平失衡有關(guān),外源性的抗氧化劑可幫助人們維持體內(nèi)自由基的平衡[3]。通過對具有抗氧化活性的天然食物進(jìn)行研究有可能開發(fā)出有效的抗氧化藥物和保健食品。研究發(fā)現(xiàn)植物蛋白、動物蛋白以及微生物蛋白中能水解分離出抗氧化肽[4]。閔建華等[5]以水解度和DPPH·清除能力為指標(biāo),趙鐘興[6]、李高揚(yáng)等[7],以DPPH·清除能力為指標(biāo),盧楠等[8]以總還原能力為指標(biāo)對酶解過程進(jìn)行分析,優(yōu)化了蠶蛹蛋白酶解的最佳工藝,并對水解產(chǎn)物多肽的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。生物活性肽是近年來研究的熱點,為了提高蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性,本文選用了不同的酶酶解繅絲蠶蛹蛋白并對酶解產(chǎn)物的抗氧化能力進(jìn)行了探討,期望為蠶蛹的深加工和綜合利用提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

表1 五種酶最適水解條件表 Table 1 The table of five enzymes optimal hydrolyse conditions

1 材料與方法

1.1材料與儀器

繅絲蠶蛹 由重慶合川太和絲廠提供;脫脂蠶蛹蛋白(≥77. 31%) 自制,將干燥的繅絲蠶蛹粉碎,用索氏提取器用石油醚作溶劑抽提12h以去除其中的脂肪,剩余物干燥、粉碎而得脫脂蠶蛹蛋白粉;蠶蛹蛋白水解專用酶、中性蛋白酶 南寧東恒華道生物科技有限公司;木瓜蛋白酶、風(fēng)味酶、胰酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司;二苯代苦味?；?DPPH) Sigma公司;其他常用試劑均為分析純。

pHs - 3C酸度計 上海三信儀表廠;5810型臺式高速離心機(jī) Eppendorf;UV - 2405分光光度計 日本島津公司。

1.2實驗方法

1. 2. 1 繅絲蠶蛹蛋白的酶解 根據(jù)前期研究結(jié)果,選取以下5種單酶或雙酶對脫脂的繅絲蠶蛹蛋白進(jìn)行酶解,酶解條件[9]如表1所示。采用恒溫水浴維持水解溫度不變,酶解過程中不斷滴加1mol/L的NaOH或HCl溶液維持pH穩(wěn)定,4h后停止酶解,沸水浴10min滅酶,迅速冷卻至室溫后用純水補(bǔ)足在酶解過程散失的水分,4000r/min離心15min,收集上清液,冷凍備用進(jìn)行抗氧化能力的研究。

1. 2. 2 酶解產(chǎn)物還原力的測定 參考Oyaizu[10]的鐵氰化鉀還原法將酶解所得的繅絲蠶蛹蛋白酶解液稀釋100倍進(jìn)行測定,同時作試劑空白。

將繅絲蠶蛹蛋白酶解液稀釋10倍進(jìn)行超氧陰離子清除率的測定。以1. 0mL蒸餾水加入2. 5mL的0. 1mol/L Tris - HCL緩沖溶液(pH8. 2,其中含1mmol/L EDTA)調(diào)零,加入10μL 50mmol/L的鄰苯三酚(25℃水浴預(yù)熱)迅速混勻,在320nm處每隔30s讀取吸光度1次,5min后結(jié)束測定。作吸光值隨時間變化的回歸方程,其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V1。

式中:V1- 對照組鄰苯三酚自氧化速率;V2- 樣品組鄰苯三酚自氧化速率。

1. 2. 4 酶解產(chǎn)物對羥自由基(·OH)清除能力的測定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[13 - 14]的方法將繅絲蠶蛹蛋白酶解液稀釋10倍進(jìn)行對·OH清除率的測定。

1. 2. 5 酶解產(chǎn)物對二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的測定 測定方法根據(jù)參照文獻(xiàn)[15]略加修改而得。

將繅絲蠶蛹蛋白酶液稀釋100倍進(jìn)行對DPPH·清除率的測定。用乙醇配制20μg/L DPPH·溶液,避光保存?zhèn)溆谩７謩e取3. 0mL繅絲蠶蛹蛋白酶解稀釋液于試管中,加入3. 0mL20μg/L DPPH·溶液,搖勻,放置30min后在517nm處測定其吸光值。在相同反應(yīng)體系下分別測定樣品組、樣品空白組、空白對照組的吸光值。DPPH·的清除率計算公式如下:

式中:A1- 空白對照組的吸光值;A2- 樣品組的吸光值;A3- 樣品空白組的吸光值。

每項實驗重復(fù)3次以上,實驗結(jié)果取平均值,采用Excel 2003、SPSS17. 0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,Origin8. 0軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1五種酶對繅絲蠶蛹蛋白的水解作用

五種酶在最佳的水解條件下與繅絲蠶蛹蛋白作用,計算繅絲蠶蛹蛋白的水解度,結(jié)果如圖1所示:

圖1 五種水解酶水解度的比較Fig. 1 Comparison of five kinds of hydrolytic enzyme hydrolysis注:上標(biāo)為水解度的顯著性分析,不同字母表示不同酶解液的水解度具有顯著性差異(p<0. 05),圖2 ～ 圖5同。

從圖1可以看出,五種酶對繅絲蠶蛹蛋白的水解度均達(dá)到了20%以上,其中E2的水解作用最大,水解度為28. 44%,E3、E4、E5的水解作用次之,水解度分別為26. 81%、26. 57%、26. 46%。而E1的水解作用較低,水解度為21. 44%。雙酶水解度較單一酶水解度高,這可能是因為雙酶之間發(fā)生了協(xié)同作用,促進(jìn)了蠶蛹蛋白的水解。

以這5種酶酶解繅絲蠶蛹得到的水解產(chǎn)物為樣本,研究它們的體外抗氧化能力。

2.2繅絲蠶蛹蛋白酶解物還原力評價

多項研究表明,抗氧化活性與還原力存在正相關(guān)性[16 - 18]。還原力可表示抗氧化物質(zhì)提供電子的能力,還原能力強(qiáng)的物質(zhì)可以與自由基反應(yīng),通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì),從而阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),為實驗材料清除活性氧等自由基或發(fā)揮抗氧化作用提供可能[19]。將繅絲蠶蛹蛋白酶解液稀釋100倍測定其還原力,實驗結(jié)果如圖2所示:

圖2 五種蠶蛹蛋白酶解物還原力的比較Fig. 2 Comparison of reducing power capability of five Silk reeling silkworm pupa protein hydrolysate

還原力主要用于評價抗氧化劑在氧化還原反應(yīng)過程中整體的抗氧化能力[20]。以吸光值表示還原力,吸光度越高,還原能力越強(qiáng)。由圖2可以看出,P1(蠶蛹蛋白水解專用酶酶解產(chǎn)物)的還原力最高,在700nm處的吸光度達(dá)到0. 75,顯著(p<0. 05)高于雙酶酶解生成多肽的還原力。雙酶酶解生成的多肽中,P4(胰酶+中性蛋白酶酶解產(chǎn)物)還原力最高,在700nm處的吸光度為0. 54,P3(蠶蛹蛋白水解專用酶+木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物)和P5(胰酶+風(fēng)味酶酶解產(chǎn)物)的還原力顯著(p<0. 05)低于P4,700nm處的吸光度分別0. 49和0. 51,P2(蠶蛹蛋白水解專用酶+風(fēng)味酶酶解產(chǎn)物)的還原力最低,700nm處的吸光度為0. 42。

由上可知,只采用E1酶解蠶蛹蛋白得到的多肽還原力高于復(fù)合酶酶解得到的多肽。

超氧陰離子自由基本身不太活潑,但可通過歧化反應(yīng)和其它反應(yīng)途徑產(chǎn)生OH·,是生物體系中自由基產(chǎn)生的根源[21]。人體內(nèi)的超氧陰離子一旦與羥基自由基(OH·)結(jié)合,其產(chǎn)物會導(dǎo)致細(xì)胞DNA損壞,破壞人類機(jī)體功能,而且其衍生的自由基也具有細(xì)胞毒性,會導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷及細(xì)胞膜損傷[22]。5種繅絲蠶蛹蛋白酶解原液稀釋10倍后對超氧陰離子的清除效果的實驗結(jié)果如圖3所示:

圖3 五種繅絲蠶蛹蛋白酶解物對清除率的比較Fig. 3 Comparison of superoxide anion radical scavenging activity of five Silk reelingsilkworm pupa protein hydrolysate

2.4繅絲蠶蛹蛋白酶解物對·OH的清除能力

·OH是已知的存在于需氧生物代謝過程中的最強(qiáng)的氧自由基,幾乎可以和所有的生物大分子發(fā)生不同類型的反應(yīng),其危害最大,能夠引起生物膜、蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷,導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡和機(jī)體病變[18,23 - 24]。考察將五種繅絲蠶蛹蛋白酶解物稀釋10倍對·OH的清除效果,實驗結(jié)果如圖4所示:

圖4 五種繅絲蠶蛹蛋白酶解物對·OH的清除率的比較Fig. 4 Comparison of hydroxyl radical scavenging activity of five Silk reeling silkworm pupa protein hydrolysate

由圖4可見,稀釋10倍的P5對·OH的清除率顯著(p<0. 05)高于其他組,清除率為55. 77%;稀釋10倍的P1和P4對·OH的清除率次之,分別為43. 77%和44. 52%;稀釋10倍的P3對·OH的清除率最低,僅為27. 72%。相同濃度的酶解物對·OH的清除力比對O-2·的清除力高,這可能是因為·OH極強(qiáng)的氧化能力更易于使肽類被氧化,同時肽類還能與Fe2+鰲合,從而減緩了Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH。

由上可知,采用E5酶解蠶蛹蛋白得到的多肽比其他復(fù)合酶酶解得到的多肽具有更強(qiáng)的·OH清除能力。

2.5繅絲蠶蛹蛋白酶解物對DPPH·的清除能力

DPPH·是一種較為穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,氮原子上有一個孤對電子,若孤對電子被配對,其乙醇溶液在517nm 處的吸光值減小,溶液顏色的變淺程度與配對電子數(shù)成正相關(guān)。因此,通過測定517nm 處的吸光值可以評價樣品對芳香自由基的清除能力[25]?？疾鞂⑽宸N繅絲蠶蛹蛋白酶解物稀釋100倍對DPPH·清除能力,實驗結(jié)果如圖5所示:

圖5 五種繅絲蠶蛹蛋白酶解物對DPPH·清除率的比較Fig. 5 Comparison of DPPH· radical scavenging activity of five Silk reeling silkworm pupa protein hydrolysate

由圖5可見,不同酶解物對DPPH·清除率具有顯著(p<0. 05)差異,稀釋100倍的P1對DPPH·的清除率顯著(p<0. 05)高于雙酶酶解生成的產(chǎn)物,清除率為79. 38%;稀釋100倍的P4、P5、P3和P2對DPPH·的清除率依次減小,分別為74. 70%、70. 62%、68. 71%和48. 20%,其中P1、P3、P4、P5對DPPH·的清除力均高于采用堿性蛋白酶水解產(chǎn)物對DPPH·最大的清除率(63. 40%)[5]。蠶蛹蛋白水解產(chǎn)物對DPPH·具有很強(qiáng)的清除能力,這可能是因為水解產(chǎn)物直接捕獲或與DPPH·相結(jié)合,通過還原作用把電子與質(zhì)子傳遞給DPPH·氮原子上的單電子生成DPPH2,或者與DPPH·處于平衡狀態(tài)的DPPH+發(fā)生氧化還原反應(yīng)并還原DPPH+的氮 - 氮雙鍵使其分解成三硝基苯胺[26],從而達(dá)到清除DPPH·的作用。

由上可知,只采用E1酶解繅絲蠶蛹蛋白比其他復(fù)合酶水解得到的產(chǎn)物具有更強(qiáng)的DPPH·清除能力。

3 結(jié)論

3.1在最佳的水解條件下,E2的水解作用最大,水解度為28. 44%,E3、E4、E5的水解作用次之,水解度分別為26. 81%、26. 57%、26. 46%,而E1的水解作用較低,水解度為21. 44%。

因此可采用E1酶解多肽作為抗氧化肽分離純化的原料。這為蠶蛹的深加工綜合利用及抗氧化肽的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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