徐吉敏 肖 莉 黃建華 嚴(yán) 明 黃 艷 趙鳳鳴 王明艷 葉 放△

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(江蘇 南京，210029) 2.江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院 3.南京鼓樓醫(yī)院

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是各類慢性肝臟疾病向肝硬化發(fā)展的共同病理過程，是一種主動(dòng)的基質(zhì)病理增生過程，其中，肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活是HF 發(fā)生過程中的核心事件，HF 治療的核心即是針對(duì)HSC 的治療［1，2］。本研究通過觀察紫七軟肝方含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 增殖的影響，并與扶正法黃芪一貫煎含藥血清作對(duì)照，觀察其對(duì)HF 的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 健康清潔級(jí)SD 雄性大鼠64 只，體重(200 ±20)g。購自南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地(質(zhì)量合格證許可證號(hào):SCXK (蘇)2008 -0004)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在南京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲食。

小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW 264.7，購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物研究所(ATCC 號(hào):TIB-71);大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6 由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鄭仕中教授惠贈(zèng)，為活化型永生的大鼠肝星狀細(xì)胞系。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 紫七軟肝方(由紫草、三七、虎杖、赤芍、茵陳、炙鱉甲、馬鞭草等組成，共計(jì)106g)和黃芪一貫煎(由黃芪、生地、北沙參、枸杞子、當(dāng)歸、麥冬、川楝子組成，共計(jì)105g)中藥材均購自江蘇省中醫(yī)院，依據(jù)參考公式［3］:給藥劑量=臨床用量×動(dòng)物等效面積系數(shù)×體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)血清稀釋度，由本校藥學(xué)院中藥鑒定及藥化實(shí)驗(yàn)室鑒定并分別制成質(zhì)量濃度為11g·ml-1的藥液。陽性對(duì)照組藥物秋水仙堿(COLC)，美國(guó)Sigma 公司，成人(60kg)的日用量為1mg，大鼠的劑量為成人用量的30 倍(即0.25mg·kg-1)，灌胃時(shí)用0.9%生理鹽水調(diào)制藥液濃度成0.025g·L-1。主要試劑有:DMEM 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)、胎牛血清(德國(guó)Biochrom)、胰蛋白酶 (美國(guó) Amresco)、噻唑藍(lán)(MTT)(北京Solarbio)、二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Amresco)、脂多糖(LPS) (美國(guó)Sigma)、卡西霉素(Calcimycin，美國(guó)Sigma)、青霉素和鏈霉素(山東魯抗)。

1.3 主要儀器和器材 潔凈工作臺(tái)(蘇州凈化)，RE2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)，AY220 電子分析天平(日本Shimadzu)，CKX31 倒置顯微鏡(日本Olympus)，MDF-382ECM超低溫冰箱(日本Sanyo)，HH-6 恒溫水浴鍋(常州國(guó)華)，高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Rad)，移液器(德國(guó)Gilson)。

1.4 含藥血清的制備 64 只大鼠隨機(jī)分為8 組，每組8 只，分別為紫七軟肝方高、中、低濃度組，黃芪一貫煎高、中、低濃度組，秋水仙堿組和生理鹽水組。紫七軟肝方組和黃芪一貫煎組大鼠分別以高、中、低濃度為11g、5.5g、2.75g·ml-1的水煎液，秋水仙堿組大鼠灌胃濃度為0.025g·L-1，生理鹽水組大鼠灌以0.9%生理鹽水，均按1ml/100g 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行灌胃。早晚8 點(diǎn)各灌胃1 次，連續(xù)7d，紫七軟肝方組于末次給藥2h (經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)此時(shí)效果好)、黃芪一貫煎組于末次給藥1h 后(經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)此時(shí)效果好)、秋水仙堿組和生理鹽水組均于末次給藥1h 后，頸主動(dòng)脈取血，4℃靜置4h，3000rpm 離心15min，分離血清，同組血清混勻，56℃水浴滅活30min，無菌過濾分裝后-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液的制備 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液(MCM)參照文獻(xiàn)［4］制備，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RAW264.7 細(xì)胞，待細(xì)胞數(shù)約為2 ×106/L 時(shí)，先用1μmol/L 卡西霉素孵育8h，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3 次后，再用100g·L-1LPS 孵育6h，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3 次后，最后用DMEM 培養(yǎng)液孵育24h，收集細(xì)胞上清液于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每天換液，每3d 傳代1 次;HSC-T6 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，隔天換液1 次，每3d 傳代1 次。均置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7 MTT 法檢測(cè)不同采血時(shí)間點(diǎn)的含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 增殖的影響 無菌條件下，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC-T6，顯微鏡下觀察待細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞瓶底約50%時(shí)加入MCM 共同培養(yǎng)24h，0.25%胰酶消化，顯微鏡下計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×105/ml，每孔200μl 接種于96 孔板中，置37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后(過夜)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入含20%不同濃度含藥血清的培養(yǎng)液，生理鹽水組加入等體積含藥血清培養(yǎng)液，每組均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48h 后，每孔加入新鮮配制的5g·L-1的MTT 溶液 (將100mgMTT 粉末溶解于20ml PBS 中，現(xiàn)配現(xiàn)用，無菌過濾分裝，-20℃凍存)20μl，輕微震蕩2min，繼續(xù)培養(yǎng)4h，輕輕吸棄上清，每孔加入DMSO 溶液150μL (避光操作)，水平搖床混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀于490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，重復(fù)3 次。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，根據(jù)測(cè)得的A 值判斷細(xì)胞數(shù)量，A 值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。按下式計(jì)算不同質(zhì)量濃度含藥血清對(duì)HSC-T6 增殖的抑制率(IR)，IR=(1 -A給藥組/A生理鹽水組) ×100%。

1.8 MTT 法檢測(cè)紫七軟肝方含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 增殖的影響 無菌條件下，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC-T6 和MCM 共同培養(yǎng)24h 后胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×105個(gè)/mL 后接種于96 孔板中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后(過夜)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入含20%含藥血清的培養(yǎng)液，使紫七軟肝方和黃芪一貫煎組終質(zhì)量濃度分別為2.2g、1.1g、0.55g·ml-1，秋水仙堿組和生理鹽水組加入等體積含藥血清培養(yǎng)液，每組均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h 后，依次加入MTT 溶液和DMSO 溶液，水平搖床混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀于490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A，重復(fù)3 次。(具體同1.7)。

2 結(jié)果

2.1 不同采血時(shí)間點(diǎn)的含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 的增殖抑制作用 中濃度紫七軟肝方(臨床等效劑量)灌胃后各時(shí)間點(diǎn)制備的含藥血清與生理鹽水組相比，灌胃后2h 對(duì)活化后HSC-T6 抑制作用最明顯，且48h (P ＜0.05)優(yōu)于24h (P ＞0.05);中濃度黃芪一貫煎含藥血清于灌胃后1h 對(duì)活化后HSC-T6 抑制作用最明顯，且48h (P ＜0.05)優(yōu)于24h (P ＞0.05)結(jié)果見表1、表2 和圖1。

2.2 紫七軟肝方含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 的抑制作用 紫七軟肝方含藥血清在2.2g、1.1g、0.55g·ml-1質(zhì)量濃度時(shí)作用24h、48h 和72h 后，吸光度與生理鹽水組相比均有差異(P ＜0.01)，紫七軟肝方高濃度組抑制率高于秋水仙堿組，但中、低濃度組低于秋水仙堿組，紫七軟肝方含藥血清48h 抑制率最明顯;黃芪一貫煎含藥血清在2.2、1.1、0.55 g·ml-1質(zhì)量濃度時(shí)作用24h、48h 和72h 后，吸光度與生理鹽水組相比部分有顯著差異(P ＜0.05)，24h 低濃度組與生理鹽水組相比，P ＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高、中、低濃度組均與秋水仙堿組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，黃芪一貫煎含藥血清48h 抑制率最明顯。從表3 可以看出，細(xì)胞培養(yǎng)從24h 到48h，細(xì)胞數(shù)量增加較快，而從48h 到72h，細(xì)胞數(shù)量有所下降，可能是因?yàn)樗幬锏挠绊?，也有可能是?xì)胞自身的凋亡，故72h 結(jié)果僅供參考，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義較小。如圖2 所示。

表1 中濃度紫七軟肝方含藥血清于不同采血時(shí)間點(diǎn)對(duì)活化后HSC-T6 的增殖抑制作用(±s)

表1 中濃度紫七軟肝方含藥血清于不同采血時(shí)間點(diǎn)對(duì)活化后HSC-T6 的增殖抑制作用(±s)

與生理鹽水組相比，* P ＜0.05，△P ＜0.01

表2 中濃度黃芪一貫煎含藥血清于不同采血時(shí)間點(diǎn)對(duì)活化后HSC-T6 的增殖抑制作用(±s)

表2 中濃度黃芪一貫煎含藥血清于不同采血時(shí)間點(diǎn)對(duì)活化后HSC-T6 的增殖抑制作用(±s)

與生理鹽水組比較，△P ＜0.01

圖1 不同采血時(shí)間點(diǎn)的中濃度紫七軟肝方組含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 的抑制率(上圖)和不同采血時(shí)間點(diǎn)的中濃度黃芪一貫煎組含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 的抑制率(下圖)

表3 紫七軟肝方含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 的抑制作用(±s)

表3 紫七軟肝方含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 的抑制作用(±s)

與生理鹽水組比較，* P ＜0.05，△P ＜0.01

圖2 各含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 的抑制率

3 討論

已知在HF 的形成過程中涉及的細(xì)胞主要包括HSC 和枯否細(xì)胞(Kupffer Cells，KCs)，KCs 活化后產(chǎn)生的致炎因子誘導(dǎo)HSC 活化發(fā)生HF。大量的研究者應(yīng)用HF 發(fā)生發(fā)展過程中KCs 活化前后涉及的細(xì)胞因子如TGF-β1、PDGF、瘦素等單一細(xì)胞因子誘導(dǎo)HSC 活化后進(jìn)行研究［5～7］。目前整體致炎微環(huán)境中細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)如何誘導(dǎo)HSC 活化的整體機(jī)制尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)體系中首先誘導(dǎo)KCs 活化使其產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，營(yíng)造致HSC 活化的微環(huán)境以模擬體內(nèi)HF 的發(fā)生過程。

研究表明，LPS 和Cal 可誘導(dǎo)KCs 活化［4，8］。本實(shí)驗(yàn)通過LPS 和Cal 制備的MCM，誘導(dǎo)同屬于巨噬細(xì)胞來源于成年BALB/c 雄性小鼠的巨噬細(xì)胞株-RAW264.7 細(xì)胞代替KCs 活化，RAW264.7 細(xì)胞在HF 過程中產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，激活HSC-T6，從而啟動(dòng)HF 的進(jìn)程。體外制備MCM 的目的在于模擬體內(nèi)HSC-T6 活化前的環(huán)境和致活化因素，RAW264.7 細(xì)胞活化后釋放多種細(xì)胞因子，并不是某一種或是幾種細(xì)胞因子就可以啟動(dòng)HSC-T6 的活化，而是多種細(xì)胞因子相互作用，產(chǎn)生炎性環(huán)境，通過旁分泌機(jī)制作用于HSC-T6 加速其活化、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。HSC-T6 一旦活化，即便去除致活化因素，HSC-T6 繼以自分泌的形式活化，促使HF 的發(fā)生。

國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授以清化濕熱瘀毒法為組方原則，研制成功“紫七軟肝方”是其臨床辨治肝纖維化和肝硬化常用“祛邪”為主的基本方。黃芪一貫煎是由一貫煎加黃芪而成，具有益氣養(yǎng)陰作用，是針對(duì)肝纖維化中晚期氣陰兩虛病機(jī)而常用扶正為主的基本方。這兩種不同治法的方藥在臨床上普遍應(yīng)用，但至今未見有對(duì)其防治HF 作用機(jī)制比較研究的研究報(bào)告。

中藥成分復(fù)雜，將單味藥或復(fù)方的粗提液直接作用于細(xì)胞培養(yǎng)體系，對(duì)其細(xì)胞分子水平進(jìn)行藥理研究，結(jié)果會(huì)受到其中所含的雜質(zhì)或是本被人體吸收代謝后不存在的物質(zhì)影響，亦會(huì)缺乏經(jīng)人體代謝出的或與機(jī)體反應(yīng)后得到的產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)的作用。為解決實(shí)驗(yàn)中的這些問題，日本學(xué)者田代真一于20世紀(jì)80年代提出含藥血清實(shí)驗(yàn)方法的設(shè)想，并進(jìn)行了一系列研究后，于1988年提出了血清藥理學(xué) 的概念和實(shí)驗(yàn)方法［9］。這一方法具有兩大優(yōu)點(diǎn):①體現(xiàn)復(fù)方體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化效應(yīng);②克服藥物本身理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的直接干擾［10］。但其也存在一定的缺點(diǎn):給藥方案難以確定;無法判斷體外培養(yǎng)體系內(nèi)藥物濃度與血藥濃度的關(guān)系;藥效最佳的采血時(shí)間難以確定;不同批次制備得到的或是低溫凍存后的含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果重復(fù)性差;血清中固有的活性成分常影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果等［11～13］。本實(shí)驗(yàn)在探索制備含藥血清時(shí)考慮到以下5 個(gè)方面［14］:第一，考慮到本次試驗(yàn)涉及的HSC -T6 的種屬是大鼠，為了血清和細(xì)胞的同種屬性，故選擇制備的動(dòng)物是SD 大鼠;第二，給藥方法中采取每日給藥2 次，給藥周期為1 周，重復(fù)多次給藥使血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)，取得的含藥血清藥理作用強(qiáng)度較高;第三，采血時(shí)間是通過必要的時(shí)效關(guān)系研究，將藥效達(dá)峰時(shí)間作為采血時(shí)間，能夠較為細(xì)致地進(jìn)行含藥血清研究，避免了假陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的出現(xiàn);第四，根據(jù)能充分反映藥效、有利于實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、快捷的原則，本次試驗(yàn)中大鼠的采血部位確定為頸動(dòng)脈，并通過心外按壓大鼠期望得到盡可能多的血液;第五，為了避免單樣本對(duì)整組結(jié)果的影響，對(duì)同組血清采取混勻滅活，并無菌分裝保存，同時(shí)也避免了反復(fù)凍存對(duì)含藥血清的影響。

本實(shí)驗(yàn)在探索制備含藥血清時(shí)發(fā)現(xiàn)，紫七軟肝方和黃芪一貫煎分別于灌胃后2h、1h 采血制備得到的含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 抑制作用最明顯，且48h 均優(yōu)于本組的24h，但黃芪一貫煎灌胃后3h 得到的含藥血清作用于活化后HSC-T6 細(xì)胞48h 后出現(xiàn)的高抑制率與藥物在大鼠體內(nèi)代謝規(guī)律不一致，其原因尚有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)，紫七軟肝方含藥血清在2.2g·ml-1、1.1g·ml-1、0.55g·ml-1質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)活化后HSC-T6 抑制率在48h 時(shí)最明顯，且隨濃度的增大而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，用MCM 培養(yǎng)HSC-T6 細(xì)胞48h 后即予藥物治療，尚處于HF 早中期階段，故而出現(xiàn)代表祛邪法的各劑量組紫七軟肝方含藥血清對(duì)活化后HSC-T6 的抑制作用均優(yōu)于代表扶正法的黃芪一貫煎含藥血清這一結(jié)果，符合HF 的早期以祛邪為主、中期祛邪與扶正并存、晚期治以扶正這一治則共識(shí);高濃度紫七軟肝方含藥血清的抑制作用高于陽性對(duì)照組，中、低濃度的抑制作用低于后者。臨床上秋水仙堿治療肝纖維化作用明確，但其存在一定的毒副作用，在本次實(shí)驗(yàn)制備含藥血清中亦有所體現(xiàn):大鼠灌胃后出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、皮下出血、眼睛出血、尿血、便血等，而同時(shí)灌胃的中藥組和生理鹽水組均未出現(xiàn)上述表現(xiàn)。

本研究揭示紫七軟肝方對(duì)HSC-T6 活化的抑制作用確切，優(yōu)于黃芪一貫煎，但其機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

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