袁運 張和禹

（安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 230036）

家蠶核型多角體病毒蛋白質(zhì)組學的研究進展

袁運 張和禹

（安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 230036）

家蠶核型多角體病毒（BmNPV）屬于桿狀病毒，是一類對家蠶具有高致病性的病原體。對家蠶BmNPV的生物學特性以及新的BmNPV蛋白的鑒定和抗BmNPV的研究發(fā)現(xiàn)進行綜述，并指出當前Bm－NPV蛋白質(zhì)組學的研究階段，為BmNPV的蛋白質(zhì)組學的進步發(fā)展提供參考。

家蠶；核型多角體病毒；蛋白質(zhì)組

2009年8月家蠶基因組計劃的結(jié)束，標志著在物種基因組計劃中家蠶跑到了前沿和領(lǐng)先地位，家蠶后基因組時代已經(jīng)到來。作為家蠶的主要病原體之一的核型多角體病毒（NPV），自然也是目前研究的主要對象。家蠶核型多角體病毒（BmNPV）病是養(yǎng)蠶業(yè)上最常見危害最嚴重的蠶病之一，以春蠶期和晚秋期發(fā)生較多。BmNPV感染會引發(fā)血液型膿病，感染后期常流出膿汁，俗稱膿病，是一種急性傳染病。在感染大約12～18小時后，BmNPV觸發(fā)宿主家蠶基因表達和蛋白質(zhì)合成的總體關(guān)閉。該病傳染性極強，常呈爆發(fā)態(tài)勢，難以控制，致死率很高，常造成巨大的經(jīng)濟損失。筆者對家蠶BmNPV的生物學特性，以及BmNPV的蛋白和抗BmNPV的研究進展進行綜述，以促進對BmNPV的深入了解。

1 BmNPV的生物學特性

BmNPV為環(huán)狀雙鏈DNA病毒，屬于桿狀病毒科。由囊膜、衣殼和髓核組成，衣殼與髓核構(gòu)成核衣殼。BmNPV有兩種形式：一種為包含體衍生病毒（ODV），另一種為細胞外芽生病毒（BV）。ODV和BV的囊膜是由不同途徑產(chǎn)生的，ODV的囊膜能結(jié)合多角體蛋白，它能保護病毒顆粒在外界傳播過程中免遭環(huán)境因素的破壞而失活以及保證病毒顆粒在適當?shù)奈恢冕尫?，引起感染。ODV能特異性感染中腸上皮的柱狀細胞，而BV則與血腔和體腔內(nèi)許多組織細胞發(fā)生特異性作用。ODV和BV進入宿主細胞的方式也不同，ODV主要借助柱狀細胞的微絨毛與病毒囊膜的膜融合作用，而BV主要是通過吸附，胞飲作用進入細胞。

核型多角體病毒的基因表達分為4個階段：立即早期基因表達、早期基因表達、晚期基因表達和極晚期基因表達。BV病毒產(chǎn)生于感染早期，僅為單個病毒粒子形式，在細胞核內(nèi)產(chǎn)生后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，并從質(zhì)膜“出芽”而獲得囊膜。BV病毒是個體內(nèi)細胞間的感染形式，進入血淋巴系統(tǒng)中感染其它部位的細胞或直接在臨近細胞內(nèi)感染。ODV病毒產(chǎn)生于感染極晚期，在感染的細胞核內(nèi)形成有囊膜蛋白包被的ODV，然后多角體蛋白包裹ODV，形成包含體（OB）。自然界中，BmNPV以包含體OB的形式存在。ODV病毒是昆蟲間水平感染的病毒形式，昆蟲往往是食入污染了OB的食物后引起感染。感染早期，復制的核衣殼會從被感染的細胞中釋放出來，形成BV。感染極晚期后，新形成的核衣殼在細胞核內(nèi)形成有囊膜蛋白包被的ODV，然后多角體蛋白包裹ODV形成OB。在家蠶死亡和液化后，釋放在環(huán)境的OB重新啟動新一輪感染。

2 BmNPV內(nèi)最新的蛋白質(zhì)組鑒定

在2011年，Katsuma，S等對BmNPV基因組的轉(zhuǎn)錄單位進行了大量的鑒定。從感染BmNPV的BmN細胞構(gòu)建了全長cDNA文庫。從4 679個BmNPV來源的轉(zhuǎn)錄單位，隨機測序了11 520個克隆。發(fā)現(xiàn)了一系列早期或晚期啟動子基序有關(guān)的新轉(zhuǎn)錄以及預測了非編碼RNAs。這些為復雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了新視野。此外，在單個蛋白質(zhì)研究中也取得了不少的成果［1］。

2.1 Bm134

BmNPV的ORF134［2］是苜蓿銀紋夜蛾（Ac－NPV）ORF5的一個同源物。RT－PCR和Western印跡顯示，Bm134的蛋白表達和轉(zhuǎn)錄直到感染24小時后，才被檢測到，說明Bm134是一個晚期基因。Western印跡還顯示，Bm134編碼一個12.4kDa結(jié)構(gòu)蛋白，關(guān)聯(lián)ODV而不是BV。免疫熒光顯示，Bm134在感染24小時后，先出現(xiàn)在細胞質(zhì)，感染晚期轉(zhuǎn)運到細胞核。在易感菌株306感染后48～72小時，檢測到Bm134的轉(zhuǎn)錄和對應(yīng)蛋白，而在抗BmNPV菌株NB中則沒有。這些結(jié)論顯示，Bm134是一個BmNPV的晚期基因，可能作為ODV的結(jié)構(gòu)蛋白。

2.2 Bm61

BmNPV的ORF61［3］在所有鱗翅類桿狀病毒都存在同源物。研究者構(gòu)建了一個Bm61敲除病毒，發(fā)現(xiàn)Bm61缺失的桿粒，導致BV產(chǎn)物的缺陷。進一步電子顯微鏡分析顯示，核衣殼沒有從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。這表明，在BV路徑，Bm61對核衣殼從細胞核到細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至關(guān)重要。

2.3 Bm71

BmNPV的ORF71［4］不是核心基因，是苜蓿銀紋夜蛾（AcNPV）ORF88的一個同源物。研究者構(gòu)建了一個中斷的Bm71－D病毒，檢測整個病毒生命周期，Bm71中斷物對病毒復制和病毒的表型的影響。結(jié)果顯示，Bm71－D桿粒能成功轉(zhuǎn)染Bm5細胞系，產(chǎn)生BV。但是感染期間，BV滴度比野生型病毒低10～100倍。同時幼蟲的生物測定顯示，Bm71－D病毒比野生型要長7.5小時殺死家蠶幼蟲。用透射電子顯微鏡觀察到感染Bm71－D的細胞有典型的病毒基質(zhì)，一束束核衣殼蛋白和多面體。這些結(jié)果顯示，盡管Bm71對BmNPV的復制不是必需基因，但是對BV的產(chǎn)量和毒性有重要影響。因此，推測Bm71可能與控制病毒增殖的調(diào)控有關(guān)。

2.4 Bm54

BmNPV的ORF54［5］是苜蓿銀紋夜蛾（Ac－NPV）ORF66的一個同源物。是病毒橋粒斑蛋白N末端超家族成員，是核衣殼蛋白從細胞核的高效出口和包含體形成的必需物。研究者構(gòu)建了一個缺失Bm54的基因桿粒，用透射電子顯微鏡分析顯示，轉(zhuǎn)染缺失Bm54的病毒的細胞產(chǎn)生非感染性的BVs。另外電子顯微鏡顯示，雖然Bm54的缺失不影響核衣殼蛋白的組裝和釋放，但是它嚴重影響多面體的形成。總而言之，Bm54的缺失導致非感染性的BV和缺陷的多面體。這與AcNPV66在病毒生命周期的調(diào)控截然不同。

2.5 Bm65

BmNPV的ORF65［6］是一個高度保守基因，編碼一個104個氨基酸的蛋白質(zhì)。用同源重組構(gòu)建一個Bm65敲除桿粒。熒光顯微鏡顯示在BmN細胞內(nèi)，Bm65敲除病毒不能產(chǎn)生感染性的BV。另外實時定量PCR分析證實Bm65缺失不影響病毒DNA的復制。結(jié)論是Bm65對BmNPV的增殖是必需的，但是對病毒的DNA復制不是必需的。

2.6 其他蛋白

BmNPV的ORF75［7］的晶體結(jié)構(gòu)是一個非典型的巰基氧化酶的偽二聚化結(jié)構(gòu)，基因組序列分析顯示FAD輔基關(guān)聯(lián)類似人源重組靜息巰基氧化酶的巰基氧化酶結(jié)構(gòu)域，催化二硫鍵的形成，是病毒粒子組裝與病毒傳播所必需的。BmNPV的ORF8［8］是早期基因表達，Bm8蛋白和IE 1共定位到特定細胞核聚集點，已經(jīng)證實IE 1和BmNPV hr促進Bm8的定位。另外Bm8還關(guān)聯(lián)膜結(jié)合蛋白和分泌蛋白，是一個涉及多個信號通路的多功能蛋白。ORF91［9］是ODV的包膜組分，但是它的缺失沒有顯著影響NPV的傳染性，而是延長了半數(shù)致死時間。IE 2［10］的二聚化和適當?shù)慕到鈱λ拗鲀?nèi)病毒的高效生長是關(guān)鍵步驟。但是在人工培養(yǎng)細胞內(nèi)對BmNPV影響很小。

3 抗BmNPV病毒的最新研究

2013年為了研究家蠶對BmNPV抗性的分子機制，Chen，KP等［11］用高度抗性菌株NB和高度易感菌株306構(gòu)建了一個攜帶BmNPV抗性的近等基因系BC8。然后用微陣列研究感染12小時后，BC8和306的中腸內(nèi)基因表達的變化，鑒定了92個差異表達基因。實時熒光定量PCR分析證實，在BC8和NB的中腸相比，10個基因顯著上調(diào)或者下調(diào)。5個基因（Bm123，Bm122，COP beta＇，aquaporin，glycoside hydrolases）的抗病毒作用也被證實。研究還發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶與之前報道的數(shù)據(jù)不是完全一致。這些結(jié)果給BmNPV免疫反應(yīng)的分子機制提供了新的視野。此外，在同時期還有很多其他關(guān)于抗BmNPV的研究。

3.1 Caspase－1和絲氨酸蛋白酶

通過蛋白質(zhì)組學方法和遺傳雜交［12］，總體識別在親本家蠶NB和306以及他們F1代雜交內(nèi)的蛋白的差異表達。在正交組（NB母本，306父本，F(xiàn)1代雜交）有53個差異蛋白，在反交組（306母本，NB父本，F(xiàn)1代雜交）有21個。通過GO（Gene ontology）和KEGG pathway分析顯示，大部分差異蛋白定位在細胞質(zhì)，并且涉及一些重要的新陳代謝。Western印跡進一步證實，Caspase－1和絲氨酸蛋白酶僅僅表達在抗BmNPV家蠶。這些數(shù)據(jù)顯示，Caspase－1和絲氨酸蛋白酶在抗BmNPV感染中起到關(guān)鍵作用。另外［13］證實在感染BmNPV后，絲氨酸蛋白酶抑制基因（SPIs）有3個明顯上調(diào)，9個明顯下調(diào)。

3.2 泛素蛋白酶體系統(tǒng)

在細胞內(nèi)蛋白的降解中泛素蛋白酶體系統(tǒng)［14］起到關(guān)鍵作用，同時在高效病毒感染也被需要。研究發(fā)現(xiàn)在NPV感染的BmN4細胞內(nèi)，特定的蛋白酶體抑制子MG－132顯著地減少了BV的產(chǎn)物和多角體蛋白的表達。Western印跡分析顯示用MG－132處理的細胞導致延遲和/或異常調(diào)節(jié)病毒基因產(chǎn)物表達。感染12小時后MG－132顯著地降低BV產(chǎn)物，然而在感染6小時后，多角體蛋白表達的抑制幾乎廢除。這些顯示在早期感染階段需要病毒和/或宿主蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解，實現(xiàn)高效多角體蛋白表達。進一步研究，BmNPV感染內(nèi)泛素信號的作用，在BmNPV基因組刪除泛素基因（v－ubi）。v－ubi的缺失既不影響B(tài)V產(chǎn)物也不影響多角體蛋白的表達。此外，western印跡也顯示，泛素蛋白酶體系統(tǒng)內(nèi)一個目標病毒蛋白IE2的降解不需要vubi。總之，宿主內(nèi)的泛素蛋白酶體系統(tǒng)與高效的病毒增殖有關(guān)。

3.3 氯化鈰（CeCl3）

小劑量的稀土能增加動物免疫能力。添加氯化鈰（CeCl3）［15］到人工飼料，顯著降低BmNPV引起的五齡幼蟲的生長抑制和死亡率。此外，在感染BmNPV五齡幼蟲內(nèi)添加CeCl3明顯減少脂質(zhì)過氧化水平和活性氧的累積［例如：O（2）（－），H2O2，（OH）－O－center dot，和NO］，還能增加抗氧化酶的活性，包括：超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、抗壞血酸和谷胱甘肽。另外，在感染BmNPV五齡幼蟲內(nèi)添加CeCl3能顯著促進乙酰膽堿酯酶活性和減弱誘導型一氧化氮合酶的活性。這些發(fā)現(xiàn)暗示添加CeCl3通過增加抗氧化能力和乙酰膽堿酯酶活性，可能減輕BmNPV感染引起的氧化損傷和家蠶的神經(jīng)中毒。

3.4 二氧化鈦微粒

感染BmNPV的家蠶幼蟲吸收二氧化鈦微粒［16］（TiO2NPs），減少活性氧和NO累積，反過來減少他們的生長抑制和死亡率。另外，TiO2NPs顯著促進抗性相關(guān)基因的表達，包括那些編碼超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、熱激蛋白21、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶O1、P53、細胞色素p302和一氧化氮合成酶。這些發(fā)現(xiàn)對明白添加TiO2NPs的家蠶幼蟲對BmNPV的抗性機制是一個有用的補充。在養(yǎng)蠶方面，這些信息也提供TiO2NPs應(yīng)用的一個理論基礎(chǔ)。

3.5 其他抗病毒研究

肌動蛋白對病毒粒子轉(zhuǎn)運和病毒基因表達至關(guān)重要。A3肌動蛋白［17］第一個內(nèi)含子里面一個隱藏的啟動子控制著一個罕見亞基的表達。不同抗性菌株的A3肌動蛋白基因的第一個內(nèi)含子的大小和核苷酸組成不同。這些內(nèi)含子啟動子的不同結(jié)構(gòu)和BmNPV抗性相關(guān)。用RT－PCR和實時定量PCR鑒定NB、306、BC8菌株內(nèi)家蠶精氨酸激酶［18］（BmAK）的表達譜，結(jié)果顯示在NB和BC8菌株內(nèi)，BmAK的表達水平在接種后24小時增長了十倍以上，而306則沒有。

4 結(jié)語

目前為止，已經(jīng)從DNA、RNA、蛋白質(zhì)水平對家蠶和BmNPV展開了細致的研究。鑒定了許多家蠶和BmNPV基因，在表達蛋白質(zhì)組學上有很大進展，為后基因組時代奠定了堅實的基礎(chǔ)。但是這些鑒定出來的基因都成發(fā)散存在的形式。在細胞圖譜蛋白質(zhì)組學上，仍然沒有蛋白與蛋白或者蛋白與基因的相互作用的相關(guān)研究，沒有提出類似Lac等關(guān)于基因調(diào)控的操縱子模型等，沒有形成清晰的、系統(tǒng)的生物學機理，沒有建立細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的復雜網(wǎng)絡(luò)圖。酵母雙雜交實驗或者熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，今后應(yīng)該常用在家蠶和BmNPV的研究中，幫助找到基因或蛋白上下游的作用因子，解釋家蠶和BmNPV的詳細表達機制，另外，蛋白晶體的分子結(jié)構(gòu)測定，對解釋分子的相互作用機制必不可少?？傊?，目前的研究，還處于早期的蛋白質(zhì)功能測定，要形成系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學，還需要更加深入系統(tǒng)的研究。

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