張蕓香,劉晶晶,白晉華,郭紅彥,郭晉平

(山西農業(yè)大學 林學院,山西太谷 030801)

文冠果(XanthocerassorbifoliaBunge.)屬無患子科文冠果屬，落葉喬木和灌木，廣泛分布于我國北方荒山坡地、溝谷間和丘陵地帶，有較強的適應性和抗逆能力，根系發(fā)達、根蘗能力強，是優(yōu)良的水土保持樹種、園林綠化樹種、蜜源植物和生物質能源樹種[1，2]。

文冠果人工栽培的時間并不長，目前仍處于野生和半野生的狀態(tài)。在長期的自然雜交下，文冠果群體內形成了許多類型，具有豐富的遺傳多樣性；產量良莠不齊，卻存在著豐產性能好的優(yōu)良單株[3，4]。因此，選擇優(yōu)良單株進行無性繁育，對優(yōu)良單株進行無性系鑒定，找出經濟性狀(豐產性能)優(yōu)異的無性系，培育出豐產性能好的品系(或品種)是當前非常迫切和艱巨的一項任務。

簡單重復序列間擴增(Inter-Simplie Sequence Repeat，ISSR-PCR)是近年來在微衛(wèi)星技術上發(fā)展起來的一類新型的分子標記技術[5]，具有多態(tài)性高，穩(wěn)定性好，不需預知基因序列，檢測速度快，產物特異性強，DNA用量少，技術要求低，技術成本低等特點[6]?，F已被廣泛應用于遺傳多樣性、品種鑒定、系統(tǒng)進化、基因定位、遺傳圖譜等方面的研究[7～11]。由于ISSR分子標記技術基于聚合酶鏈式反應Polymerase Chain Reaction，PCR[12]，其反應條件受模板DNA濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、退火溫度等多個因素的影響。為保證結果的清晰、可靠和準確，減少實驗的盲目性，必須對這些因素進行優(yōu)化，構建特異性反應體系。為此，本研究采用均勻設計，對影響文冠果ISSR-PCR反應的引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度和dNTP濃度等4個主要因素在5個水平上進行優(yōu)化試驗，建立文冠果ISSR-PCR最佳反應體系，為今后PCR反應體系優(yōu)化方法的選擇提供參考。通過對文冠果基因組DNA的PCR擴增，淘汰無擴增帶和擴增后條帶不理想的引物，從中選取多態(tài)性高，條帶清晰、重復性好、穩(wěn)定性高的引物作為文冠果ISSR分析引物，同時結合對擴增反應循環(huán)次數的優(yōu)化，獲得文冠果ISSR-PCR反應的最佳擴增程序，為文冠果種質資源遺傳多樣性研究及系統(tǒng)保護提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以文冠果實生苗幼葉為試驗材料。種子采自山西省襄汾縣苗圃，經冬季低溫沙藏處理，春季種于花盆中，長出真葉后，用已滅菌剪刀剪取嫩葉，稱取所需質量，用去離子水沖洗干凈后，立即用于試驗。

1.2 主要試劑及儀器

試驗所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的第9套ISSR引物序列，由北京奧科生物工程公司合成。TaqDNA聚合酶、Mg2+和 dNTP購自天根生化科技有限公司。Marker采用BM 2000，購自天根生化科技有限公司。PCR反應在Biometra T1型PCR循環(huán)儀上進行。

1.3 基因組DNA提取

文冠果基因組DNA提取采用改良CTAB法[13]，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。稀釋10倍后待用。

1.3.1 ISSR-PCR反應體系的正交試驗設計及PCR擴增

選用20 μL體系，模板1 μL，2×PCR buffer，UBC815為引物，針對影響PCR反應的引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度和dNTP濃度4個因素，采用兩輪均勻設計，對文冠果ISSR-PCR體系進行優(yōu)化[14]。首先選用U20(54)均勻設計表，參加PCR反應的因素水平見表1，U20(54)均勻設計方案見表2。對第一輪試驗結果進行分析，初步篩選出優(yōu)化組合，并以此作為第2輪均勻設計的依據。第2輪均勻設計的因素和水平見表3，選用均勻設計表U12(34)進行試驗(表4)。

表1 第一輪均勻設計因素與水平

表2 均勻設計U20(54)表

表3 第2輪均勻設計因素和水平

表4 均勻設計U12(34)表

1.3.2 ISSR-PCR 擴增程序優(yōu)化

以第2輪均勻設計優(yōu)化的反應體系為基礎，對文冠果ISSR-PCR擴增程序中的循環(huán)次數進行篩選優(yōu)化。擴增程序采用TaqDNA聚合酶推薦擴增程序，94℃預變性5 min，接著進行循環(huán)：94℃變性35 s，52～56℃退火35 s，72℃延伸45 s；循環(huán)結束后，72℃延伸10 min。循環(huán)次數設35、40、45 3個梯度。

2 結果與分析

2.1 ISSR-PCR體系的均勻優(yōu)化

第一輪4因素5水平均勻設計共20個處理組合的ISSR-PCR體系的擴增結果見圖1。

圖1 第一輪均勻設計實驗結果Fig.1 Amplification results of the initial uniform design注：M BM2000 Marker ；1～20 分別為表2中1～20處理。Note:M BM2000 Marker ；1～20 amplification results of treatment 1～20 in table 2.

從圖1可見，不同水平組合的ISSR-PCR體系，擴增結果有差異。組合5、6、11、14、16沒有擴增，組合1、2、19擴增帶譜彌散，難以區(qū)分；組合4、7、8、10、20擴增帶譜弱，擴增帶少；組合3、9、13、15、18帶譜模糊，有拖帶現象，辨識困難，依稀可見帶譜較多；組合12、17帶譜明顯，但有輕微拖帶現象。結合擴增帶譜的數目、強弱、清晰度等指標，組合12和17效果相對較好。為獲得理想的ISSR-PCR體系，根據組合12和17對應的因素水平上，分別設計3水平(表3)，進行第二輪均勻設計篩選(表4)，擴增結果見圖2。

由圖2可見，12個組合中，組合3、4、9擴增帶少且弱，效果差；組合1擴增帶少，亮度大，條帶不清晰；2、6、7、8、12擴增帶少，亮度大，條帶清晰；組合11擴增帶多，亮度大，條帶不清晰；組合5、10擴增帶多，亮度大，條帶清晰，效果較好。組合5(20 μL反應體系中，含dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.3 μmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1和0.4 UTaqDNA聚合酶)擴增條帶多，帶譜清晰，易分辨，被確定為第二輪均勻設計篩選結果。

2.2 循環(huán)次數對ISSR-PCR體系的影響

循環(huán)數是影響ISSR-PCR體系的重要因素，它決定了整個PCR反應的產量：循環(huán)數太少，PCR產物的量就低；循環(huán)數目多，產物相應地增加。理論上說，循環(huán)數越多，產物量越大，但實際到了反應平臺期后，PCR產物不會有明顯增加，反而引起非特異性擴增甚至無擴增[14]。

圖2 第2輪均勻設計試驗結果Fig.2 Amplification results of the secondary uniform design注：M BM2000 Marker ；1～12 分別為表4中1～12處理。Note:M BM2000 Marker ；1～12 amplification results of treatment 1～12 in table 4.

圖3中，1～3分別為45、40和35次循環(huán)的ISSR-PCR擴增結果。由圖3可見，循環(huán)次數為35次時，擴增帶較弱，隨著循環(huán)次數增加，擴增帶亮度增加，即帶譜由弱變強，表示擴增產物增加。循環(huán)次數為45次時，出現涂抹現象，擴增帶減少，40個循環(huán)對于文冠果的ISSR-PCR擴增效果最好。

圖3 不同循環(huán)次數ISSR-PCR擴增結果Fig.3 Amplification results of ISSR-PCR with different cycles注：M BM2000 Marker；1～3 分別表示循環(huán)次數為45,40,35。Note: M BM2000 Marker ；1～3 means 45 cycles，40 cycles，35 cycles，respectively.

3 討論與結論

ISSR-PCR反應對模板濃度的要求范圍較寬。馮富娟等在進行紅松ISSR-PCR反應體系優(yōu)化時證實模板純度不會影響擴增結果，模板濃度在10～200 ng·μL-1之間擴增結果相同[6]。因此，本試驗在進行優(yōu)化時沒有考慮模板純度和濃度對反應體系的影響，而是將提取的模板DNA稀釋10倍后取1μL后進行PCR擴增，取得了良好的擴增效果。

在PCR反應中，退火溫度直接決定引物與模板DNA的特異性結合，不同的物種和引物有不同的退火溫度，退火溫度過低，引物與模板的結合性差，退火溫度過高，非特異性擴增增加[15]。為此，使用不同引物時要對退火溫度進行篩選，一般以引物的退火溫度為標準±5 ℃，在此范圍內，每2 ℃為一個梯度，進行退火梯度試驗，得出試驗所用引物的最佳退火溫度，然后進行試驗。

本試驗采用U20(54)和U12(34)均勻設計表，對影響文冠果ISSR-PCR的4個主要因素進行篩選，得出在20μL體系中，四因素的最佳濃度分別為：dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.3 μmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1和TaqDNA聚合酶0.4 U。循環(huán)數為40時擴增效果最好。

參 考 文 獻

[1]程文全.優(yōu)良生態(tài)油料樹種——文冠果[J].特種經濟動植物,2007(9):34.

[2]牟洪香，侯新村，劉巧哲.木本能源植物文冠果的表型多樣性研究[J].林業(yè)科學研究,2007,20(3)：350-355.

[3]馬啟慧.能源樹種文冠果的研究現狀與發(fā)展前景[J].北方園藝,2007(8):77-78.

[4]胡薇，黃儒珠，孫端，等.均勻設計優(yōu)化建蘭ISSR-PCR體系[J].生命科學研究,2007,11(1)：58-63.

[5]Zidtkiewicz E,Rafalaske A,Labuda D.Genome finger printing by simple sequence repeal (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.

[6]馮富娟，趙丹，孫曉艷,等.紅松SSR-PCR反應體系的建立與優(yōu)化[J].經濟林研究,2010,28(1):35-40.

[7]姜偉，朱宏波，何覺民.不同來源棉花種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].棉花學報,2008,20(5)：348-353.

[8]戴正，陳力耕，童品章，等.香榧品種遺傳變異與品種鑒定的ISSR分析[J].園藝學報，2008,35(8)：1125-1130.

[9]陶曉瑜，桂先群，傅撐新，等.明黨參和川明參種間遺傳分化和系統(tǒng)關系的分子標記和ITS序列分析[J].浙江大學學報：農業(yè)與生命科學版,2008,34(5):473-481.

[10]夏德安，魏志剛，楊傳平，等.白樺長纖維性狀ISSR和SCAR標記的分析[J].東北林業(yè)大學學報,2008,36(9)：1-4.

[11]劉本英，王麗鴛，周健，等.云南大葉種茶樹種質資源ISSR指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學報,2008,9(4)：458-464.

[12]丁燦，林位夫.油棕新品種遺傳多樣性的ISSR分析[J].安徽農業(yè)科學,2010,38(4)：2202-2203,2205.

[13]陳仲華，陳金湘.棉花基因組DNA的提取及RAPD反應組成優(yōu)化探討[J].中國棉花,2004,31(9)：20-21.

[14]陳莉娉，張小平，李曉紅.青檀SRAP-PCR體系優(yōu)化設計方案[J].生物學雜志,2012,29(5)：87-91.

[15]杜欣，董玉芝，陳虹，等.均勻設計優(yōu)化喜鹽鳶尾ISSR-PCR體系[J].新疆農業(yè)科學,2008,45(3)：386-392.