侯軍霞 綜述，曾維政審校

（中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610083）

細(xì)胞治療是近年來醫(yī)學(xué)研究的熱點，并展現(xiàn)了極好的前景，廣泛應(yīng)用于心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、肝病、腫瘤等領(lǐng)域。移植細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、分布、增殖及分化等因素直接關(guān)系到治療能否成功，因此，非侵入性的細(xì)胞示蹤技術(shù)成為焦點。目前常用的體內(nèi)細(xì)胞示蹤技術(shù)包括核素成像、光學(xué)成像和核磁共振成像技術(shù)。核素成像技術(shù)通過核素（如18F、99mTc、111IN等）標(biāo)記細(xì)胞，用PET／SPECT方法可以進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，敏感度及特異度高，但具有空間分辨率低、標(biāo)記物存在輻射、半衰期短等缺點。光學(xué)成像技術(shù)則是通過生物發(fā)光劑和內(nèi)源性熒光報告基因或是外源性探針來檢測分子和生化進(jìn)程的無創(chuàng)技術(shù)，具有高敏感性、無電離輻射、可量化及費用相對較低等優(yōu)點，但是空間分辨率低、光源在生物體內(nèi)易發(fā)生散射、有背景光干擾。核磁共振成像（magnatic resonance image，MRI）技術(shù)是利用體內(nèi)固有的原子核（氫質(zhì)子），在外加磁場的作用下產(chǎn)生共振現(xiàn)象，將獲得的電信號經(jīng)過計算機(jī)處理后，重建出人體某一層面的圖像的診斷技術(shù)，由于空間分辨率高、敏感度強(qiáng)，無電離輻射、廣泛應(yīng)用于臨床等特點，受到眾多研究者的青睞。現(xiàn)將MRI對比劑在細(xì)胞示蹤中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 氧化鐵顆粒

氧化鐵通過縮短自旋－自旋弛豫時間／橫向弛豫時間（T2），產(chǎn)生負(fù)性對比效應(yīng)，在T2W1和T2＊W1上顯示為低或無信號。為了增加氧化鐵顆粒的穩(wěn)定性和可溶解性，降低對細(xì)胞功能的影響，用于細(xì)胞標(biāo)記的氧化鐵顆粒通常是由右旋糖酐、聚乙二醇（PEG）或聚苯乙烯等包裹Fe2＋和Fe3＋的氧化物的核構(gòu)成［1］。按照顆粒直徑的大小，氧化鐵顆?？梢苑譃椋撼槾叛趸F顆粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO，直徑50～200 nm），超小超順磁氧化鐵（ultra small superpara－magnetic iron oxide，USPIO，直徑35nm）和微米順磁氧化鐵納米粒子（monocr－ystalline iron oxide nanocompound，MPIO，直徑約1 μm）［1］。其中 MPIO含鐵量最高，是最敏感的對比劑，但因其由聚苯乙烯包被而成，不能被生物降解，長期存留在體內(nèi)的影響未知，因此限制了MPIO在動物研究及臨床中的應(yīng)用［2］。

迄今為止，SPIO是惟一被批準(zhǔn)用于臨床的對比劑。因其可被肝、脾、骨髓、淋巴結(jié)中的巨噬細(xì)胞吞噬而顯影，早在1996年美國FDA就批準(zhǔn)SPIO用于臨床作為特異性的肝臟對比劑使用。SPIO具有生物降解性，被細(xì)胞代謝后可進(jìn)入正常血漿鐵池與血紅蛋白結(jié)合或參與其他代謝過程［3］。通常用于MRI細(xì)胞示蹤的SPIO量約為10pg／細(xì)胞，有研究表明，該劑量對細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的不良反應(yīng)，并且細(xì)胞內(nèi)鐵的代謝較慢，但較高濃度的鐵（＞20pg）對細(xì)胞具有毒性作用，因為游離鐵離子在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生羥自由基可致細(xì)胞DNA變性［4－6］。

在健康志愿者大腿皮下注射結(jié)核桿菌誘導(dǎo)皮膚炎癥，并將SPIO標(biāo)記后的外周血單核細(xì)胞靜脈輸注到志愿者體內(nèi)，MRI可觀察到SPIO標(biāo)記細(xì)胞遷移到炎癥皮膚，且皮膚活檢證實了普魯士藍(lán)染色陽性細(xì)胞存在［7］。SPIO標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞后移植到多發(fā)性硬化癥和脊髓側(cè)索硬化癥患者的鞘膜腔及腦室內(nèi)，應(yīng)用MRI觀察細(xì)胞的遷移和分化，未發(fā)現(xiàn)與SPIO標(biāo)記有關(guān)的病理改變，表明SPIO用于臨床是安全可行的［1］。

SPIO及細(xì)胞表面均帶負(fù)電荷，不易通過胞吞或胞飲作用進(jìn)入非吞噬細(xì)胞體內(nèi)，為增加細(xì)胞標(biāo)記效率，目前最常用的方法是將SPIO顆粒包被上多聚陽離子從而使促SPIO與細(xì)胞膜結(jié)合，促進(jìn)吞噬。常用的轉(zhuǎn)染試劑有多聚賴氨酸、魚精蛋白硫酸酯、陽離子脂質(zhì)體等，通過簡單的孵育即可以標(biāo)記細(xì)胞［1］。其他標(biāo)記方法有電穿孔和超聲脈沖等。

盡管如此，SPIO作為MRI細(xì)胞示蹤劑仍有一些局限性：（1）敏感度相對較低；（2）隨著移植細(xì)胞迅速分裂，SPIO濃度會被稀釋；（3）標(biāo)記細(xì)胞死亡后被吞噬細(xì)胞或其他細(xì)胞吞噬，出現(xiàn)假陽性；（4）由于出血灶內(nèi)含有含鐵血紅素，與標(biāo)記細(xì)胞不易區(qū)分。

2 順磁性物質(zhì)

順磁性物質(zhì)用于 MRI對比劑主要有釓（Gd3＋）和錳（Mn2＋）兩類，通過影響自旋－晶格弛豫時間／縱向弛豫時間（T1），產(chǎn)生T1正性對比效應(yīng)，在T1WI顯示為高信號。

釓含有最多的不成對電子（7個），是最有效的順磁對比劑［1］。但因Gd3＋有細(xì)胞毒性，通常使用其螯合物來減少對細(xì)胞的損害。釓螯合物在低濃度下主要是縮短T1成為陽性對比劑，而在高濃度時，Gd3＋以縮短T2為主成為MR陰性對比劑。目前用于細(xì)胞標(biāo)記的濃度10～80mmol／L則以縮短T1為主［8］。目前釓對比劑主要包括 Gd－DPTA、Gd－DOTA、Gd－DO3A 等，其 中 Gd－DTPA（Gadopen－etate dimeglumine；商 品名：馬根維顯，Magnevist）是臨床最常用的對比劑，主要用于增強(qiáng)全身血供豐富的組織和病變，其臨床不良反應(yīng)主要與過敏有關(guān)，進(jìn)入體內(nèi)的Gd－DTPA 99%可經(jīng)腎臟迅速清除和排泄，因此臨床上是安全的［1，9－10］。

但是Gd－DTPA用于細(xì)胞標(biāo)記體內(nèi)示蹤卻受到限制：（1）敏感度低，且成像效果不如SPIO，（2）在細(xì)胞的溶酶體內(nèi)釓螯合物可能會迅速崩解，而釓（Gd3＋）可以導(dǎo)致腎臟纖維化已經(jīng)得到證實［9－10］。因此不適用于體內(nèi)細(xì)胞示蹤的研究。

為了減少釓對細(xì)胞的毒性影響及增強(qiáng)陽性對比效應(yīng)，出現(xiàn)了許多新型的對比劑。釓己二酮納米顆粒（GdH－NP）直徑約140nm，無細(xì)胞毒性，用于人MSCs標(biāo)記不影響細(xì)胞表面抗原表達(dá)，且內(nèi)吞入細(xì)胞內(nèi)的含量比GD－DTPA高3倍，表明細(xì)胞標(biāo)記低濃 度的 GdH－NP即 可 獲得較好 的 MRI影 像［11］。Gd2O3＠MCM－41（gadolinium－doped mosoporous silica MCM－41）擁有六角中孔結(jié)構(gòu)，可聚集納米大小的Gd2O3粒子，對細(xì)胞增殖無毒，并對標(biāo)記的細(xì)胞分化潛能影響較小，標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）在小鼠的腦內(nèi)可被臨床3TMRI觀察14d，組織切片免疫熒光檢測證實了標(biāo)記細(xì)胞的存在［12］。超小順磁Gd2O3納米顆粒（直徑1.3nm）被聚乙二醇（PEG）包被后，形成膠狀的水性介質(zhì)，具有較高的縱向弛豫時間和小的r2／r1比率。用于標(biāo)記F98腦癌細(xì)胞（多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤），標(biāo)記后移植到小鼠腦中應(yīng)用MRI觀察細(xì)胞的遷移，結(jié)果在移植后48 h每個移植動物都發(fā)現(xiàn)了腦瘤存在，表明超小PEG－Gd2O3納米顆粒可提供較強(qiáng)的陽性對比增強(qiáng)效應(yīng)，使體內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞可視化［13］。

Mn2＋是最早用于研究活體細(xì)胞示蹤的磁性粒子，有5對不成對電子，磁性和磁化率強(qiáng)于螯合的釓。將MnCl2標(biāo)記的外周血單核細(xì)胞經(jīng)肌肉注射移植到大鼠缺血下肢中，使用MRI觀察7～20d發(fā)現(xiàn)Mn標(biāo)記的MNCs分布與SPECT評價111In標(biāo)記的MNCs及熒光顯微鏡觀察Dil染色分布一致［14］。但Mn2＋具有細(xì)胞毒性，通過大鼠玻璃體注射不同濃度的MnCl2，隨著濃度的增高，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的密度迅速減少；高濃度的MnCl2對視網(wǎng)膜的毒性還包括線粒體病變，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布異常，以及光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的異常等［15］。

3 19F

19FMRI成像原理不同于SPIO，與氫核質(zhì)子無關(guān)，主要依賴于19F的自旋密度加權(quán)。因體內(nèi)背景信號低，盡管19F的影像信噪比明顯低于普通1HMRI，但檢測到的19F信號均來自標(biāo)記細(xì)胞，而且獲得信號強(qiáng)度與19F的量成正比，因此，可以量化標(biāo)記細(xì)胞［16］。19F示蹤方法的發(fā)展，依賴于過氧化碳（PFC）的使用。

PFC主要作為人工血液在手術(shù)中使用，也可作為血管系統(tǒng)的對比劑，是疏脂、疏水分子，不與細(xì)胞膜融合，需要制備成納米乳劑才能進(jìn)入細(xì)胞。目前體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)可代謝PFC的酶，且在低pH值環(huán)境中可穩(wěn)定存在，因此不會被溶酶體降解；進(jìn)入體內(nèi)的PFC主要通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)代謝作用后經(jīng)過肺呼出［16－17］。研究表明，PFC標(biāo)記細(xì)胞低于1011～1012個氟原子／細(xì)胞時，不會產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)［17］。19F標(biāo)記鼠的骨髓HSCs可造成細(xì)胞活力一過性降低，但隨后恢復(fù)正常，且標(biāo)記不改變細(xì)胞的分化潛能；在體內(nèi)試驗中，標(biāo)記后的HSCs可在脾臟內(nèi)發(fā)育成正常的CFU，在淋巴和骨髓重建上與未標(biāo)記細(xì)胞并無差別，表明標(biāo)記后的 HSCs仍保持了治療功能和潛能［18］。19FMRI檢測敏感度高，在高磁場的MRI系統(tǒng)中可以檢測到1 000個標(biāo)記細(xì)胞／voxe，Boehm－Sturm等［19］用19F標(biāo)記人的神經(jīng)干細(xì)胞，體內(nèi)外未見對細(xì)胞增殖和分化有影響，標(biāo)記后的神經(jīng)干細(xì)胞注射到小鼠的紋狀體，可用19F MRI檢測到標(biāo)記細(xì)胞，且獲得影像學(xué)圖像與組織學(xué)檢查一致。

由于19FMRI需要特殊設(shè)備，且對細(xì)胞毒性的影響不明，還需進(jìn)一步研究。但19F有望成為新的細(xì)胞示蹤方法來了解細(xì)胞行為。

4 報告基因

報告基因技術(shù)是將目的基因?qū)氚屑?xì)胞使某種物質(zhì)過表達(dá)，從而被報告探針?biāo)鶛z測的方法。主要用于放射性核素方面，目前已經(jīng)在MRI檢查中得到發(fā)展［20］。

常用的MRI報告基因有：鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，這些蛋白可使鐵在體內(nèi)蓄積，通過改變T2弛豫時間報告蛋白的活性。Iordanova等［21－22］將鐵蛋白基因?qū)胄∈竽X室下的神經(jīng)祖細(xì)胞內(nèi)，并將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞注射到小鼠紋狀體，用MRI檢測到了內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞遷移到嗅神經(jīng)球；研究發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞鐵蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白也有所增加，從而將鐵貯存在細(xì)胞內(nèi)成像。

報告基因的優(yōu)勢在于：（1）只有活細(xì)胞才能表達(dá)報告基因；（2）報告基因會隨細(xì)胞分裂傳給子細(xì)胞，不會導(dǎo)致標(biāo)記稀釋；（3）將報告基因整合與特定細(xì)胞產(chǎn)物的啟動子相連，報告基因可反應(yīng)干細(xì)胞的分化類型。

使用金屬蛋白酶報告基因為基礎(chǔ)的MRI示蹤技術(shù)也不是沒有局限性，需要考慮到時間問題：在細(xì)胞內(nèi)的鐵能夠被檢測到均需要時間的積累，因此所檢測到的信號與細(xì)胞活力直接的關(guān)系很難理解。

5 異體微膠囊

殼聚糖／藻酸鹽微膠囊是一種新型的生物材料，生物相容性好，擴(kuò)散性強(qiáng)，允許小分子營養(yǎng)物質(zhì)自由出入細(xì)胞，如葡萄糖、氧氣、胰島素等，但限制免疫球蛋白或抗原提呈細(xì)胞等進(jìn)入。因此，可以使得移植的異體細(xì)胞免受免疫排斥，也可避免免疫抑制藥物的不良反應(yīng)［23］。

將對比劑標(biāo)記在膠囊里制備成磁膠囊，可以通過MRI技術(shù)對移植細(xì)胞進(jìn)行非侵入性檢查。因為對比劑并非直接標(biāo)記細(xì)胞，所以可增加對比劑的量而提高敏感度，而不增加細(xì)胞毒性［23］。對于干細(xì)胞治療，細(xì)胞旁分泌機(jī)制的作用遠(yuǎn)大于直接分化為目的細(xì)胞，用微膠囊可提高細(xì)胞在宿主體內(nèi)的生存率，減少治療所需細(xì)胞數(shù)量［24］。將含有脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的磁性微膠囊移植治療急性心肌梗死豬模型，在移植后30d仍可用MRI觀察到標(biāo)記細(xì)胞，而單純用SPIO標(biāo)記的細(xì)胞則出現(xiàn)信號的缺失，表明磁性微膠囊可使細(xì)胞更好地停留在缺血心肌中，但在改善心肌梗死面積及心功能方面，兩組間無明顯差異［25］。磁性微膠囊不影響細(xì)胞活性及功能，且有利于體內(nèi)細(xì)胞示蹤，具有廣泛的應(yīng)用前景。

6 展 望

理想的MRI細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)應(yīng)該滿足以下特征：有較好的生物相容性，低毒或無毒，敏感度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，較高的信噪比，不會隨細(xì)胞分裂增殖而稀釋，也不會轉(zhuǎn)染周圍細(xì)胞，允許長時間示蹤細(xì)胞。如果滿足上述各種條件，則可通過MRI進(jìn)行細(xì)胞的實時監(jiān)測，并可在MRI引導(dǎo)下進(jìn)行細(xì)胞精確移植。盡管目前尚無對比劑滿足上述所有標(biāo)準(zhǔn)，但隨著細(xì)胞示蹤技術(shù)研究的深入，相信MRI細(xì)胞示蹤技術(shù)會對細(xì)胞治療帶來深遠(yuǎn)影響。

［1］Cromer Berman SM，Walczak P，Bulte JW.Tracking stem cells using magnetic nanoparticles［J］.Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol，2011，3（4）：343－355.

［2］Long CM，Bulte JW.In vivo tracking of cellular therapeutics using magnetic resonance imaging［J］.Expert Opin Biol Ther，2009，9（3）：293－306.

［3］Choi D，Kim JH，Lim M，et al.Hepatocyte－like cells from human mesenchymal stem cells engrafted in regenerating rat liver tracked with in vivo magnetic resonance imaging［J］.Tissue Eng Part Method，2008，14（1）：15－23.

［4］Chen IY，Greve JM，Gheysens O，et al.Comparison of optical bioluminescen－ce reporter gene and superparamagnetic iron oxide MR contrast agent as cell markers for noninvasive imaging of cardiac cell transplantation［J］.Mol Imaging Biol，2009，11（3）：178－187.

［5］Henning TD，Wendland MF，Golovko D，et al.Relaxation effects of ferucarbotran－labeled mesenchymal stem cells at 1.5Tand 3T：discrimination of viable from lysed cells［J］.Magn Reason Med，2009，62（2）：325－332.

［6］Henning TD，Sutton EJ，Kim A，et al.The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells［J］.Contrast Media Mol Imaging，2009，4（4）：165－173.

［7］Richards JM，Shaw CA，Lang NN，et al.In Vivo Mononuclear Cell Tracking Using Superparamagnetic Particles of Iron Oxide Feasibility and Safety in Humans［J］.Circ Cardiovasc Imaging，2012，5（4）：509－517.

［8］Baligand C，Vauchez K，F(xiàn)iszman M，et al.Discrepancies between the fate of myoblast xenograft in mouse leg muscle and NMR label persistency after loading with Gd－DTPA or SPIOs［J］.Gene Ther，2009，16（6）：734－745.

［9］Bulte JW.In vivo MRI cell tracking：clinical studies［J］.AJR Am J Roentgenol，2009，193（2）：314－325.

［10］Thomsen HS.Nephrogenic systemic fibrosis：a serious late adverse reaction to gadodiamide［J］.Eur Radiol，2006，16（12）：2619－2621.

［11］Tseng C，Shih IL，Stobinski L，et al.Gadolinium hexanedione nanoparticles for stem cell labeling and tracking via magnetic resonance imaging［J］.Biomaterials，2010，31（20）：5427－5435.

［12］Shen Y，Shao Y，He H，et al.Gadolinium3＋－doped mesoporous silica nanoparticles as a potential magnetic resonance tracer for monitoring the migration of stem cells in vivo［J］.Int J Nanomedicine，2013，8：119－127.

［13］Faucher L，Tremblay M，Lagueux J，et al.Rapid synthesis of PEGylated ultrasmall gadolinium oxide nanoparticles for cell labeling and tracking with MRI［J］.ACS Appl Mater Interfaces，2012，4（9）：4506－4515.

［14］Odaka K，Aoki I，Moriya J，et al.In vivo tracking of transplanted mononuclear cells using manganese－enhanced magnetic resonance imaging（MEMRI）［J］.PLoS One，2011，6（10）：e25487.

［15］Luo L，Xu H，Li Y，et al.Manganese enhanced MRI optic nerve tracking：effect of intravitreal manganese dose on retinal toxicity［J］.NMR Biome，2012，25（12）：1360－1368.

［16］Srinivas M，Heerschap A，Ahrens ET，et al.19F MRI for quantitative in vivo cell tracking［J］.Trends Biotechnol，2010，28（7）：363－370.

［17］Srinivas M，Turner MS，Janjic JM，et al.In vivo cytometry of antigen specific T－cells using19F MRI［J］.Magn Reson Med，2009，62（3）：747－753

［18］Helfer BM，Balducci A，Sadeghi Z，et al.19F MRI tracer preserves in vitro and in vivo properties of hematopoietic stem cells［J］.Cell Transplant，2013，22（1）：87－97.

［19］Boehm－Sturm P，Mengler L，Wecker S，et al.In vivo tracking of human neural stem cells with19F magnetic resonance imaging［J］.PLoS One，2011，6（12）：e29040.

［20］Kraitchman DL，Bulte JW.In Vivo imaging of stem cells and beta cells using direct cell labeling and reporter gene methods［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29（7）：1025－1030.

.［21］Iordanova B，Ahrens ET.In vivo magnetic resonance imaging of ferritin－based reporter visualizes native neuroblast migration［J］.Neuroimage，2012，59（2）：1004－1012.

［22］Iordanova B，Robison CS，Ahrens ET.Design and characterization of a chimeric ferritin with enhanced iron loading and transverse NMR relaxation rate［J］.J Biol Inorg Chem，2010，15（6）：957－965.

［23］Barnett BP，Arepally A，Karmarkar PV，et al.Magnetic resonance－guided，real－time targeted delivery and imaging of magnetocapsules immunoprotecting panc－reatic islet cells［J］.Nat Med，2007，13（8）：986－991.

［24］Doyle B，Sorajja P，Hynes B，et al.Progenitor cell therapy in a porcine acute myocardial infarction model induces cardiac hypertrophy，mediated by paracrine secretion of cardiotrophic factors including TGFbeta1［J］.Stem Cells Dev，2008，17（5）：941－951.

［25］Gomez－Mauricio RG，Acarregui A，Sánchez－Margallo FM，et al.A preliminary approach to the repair of myocardial infarction using adipose tissue－derived stem cells encapsulated in magnetic resonance－labelled alginate microspheres in a porcine model［J］.Eur J Pharm Biopharm，2013，84（1）：29－39.