田洪超， 叢浩龍， 田 波

(1. 中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所， 北京 100101； 2. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230601)

腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬成員。病毒顆粒為20面體的立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜和突起，直徑約30 nm。EV71基因組為長(zhǎng)約7.4 kb的單股正鏈RNA，只有一個(gè)開(kāi)放閱讀框。EV71能引起手足口病，以及嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)病變，包括無(wú)菌性腦膜炎，腦干炎，脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹和神經(jīng)性咽炎甚至死亡[1-3]。當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞后，會(huì)通過(guò)一系列的與宿主細(xì)胞間的相互作用，來(lái)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，使其更有利于病毒的生存或復(fù)制[4]。

鈣離子是生物體內(nèi)最重要的無(wú)機(jī)離子之一，鈣離子能夠調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的多種生理活動(dòng)，例如，荷爾蒙分泌，細(xì)胞增殖與分化，基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞凋亡等等[6-7]?，F(xiàn)已知多種病毒感染會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化，丙型肝炎病毒(HCV)能夠增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，釋放出的鈣離子在HCV的影響下被線粒體吸收，從而增加線粒體內(nèi)鈣離子的濃度并進(jìn)一步影響細(xì)胞的一系列功能[12]。Chami等人也證明了乙型肝炎病毒(HBV)能影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子的平衡，并通過(guò)這種方式對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生重要的影響[13]。對(duì)柯薩奇病毒的研究中也發(fā)現(xiàn)，柯薩奇病毒可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子的重排，而且通過(guò)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)鈣離子的重排會(huì)引起柯薩奇病毒釋放的延遲[5]。此外，牛痘病毒，仙臺(tái)病也能夠?qū)?xì)胞內(nèi)鈣離子產(chǎn)生一定的影響[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，EV71感染細(xì)胞后同樣會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子的分布發(fā)生變化，這一變化可能為EV71引起細(xì)胞凋亡提供重要的線索。

1 材料和方法

1.1 材料

腸道病毒71 (BrCr) 標(biāo)準(zhǔn)株(實(shí)驗(yàn)室留存)；人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251)和HaLa細(xì)胞培養(yǎng)于含有雙抗(青霉素和鏈霉素均為1%)及10%胎牛血清的DMEM (life technology)培養(yǎng)基。無(wú)鈣DMEM，購(gòu)自美國(guó)life technology公司。鈣離子熒光探針Fluo-3購(gòu)自碧云天，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，X-rhod-1購(gòu)自美國(guó)life technology公司。

1.2 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的檢測(cè)

1.2.1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度變化

將HeLa細(xì)胞分至六孔板，貼壁12 h， EV71感染細(xì)胞8 h，平均每個(gè)細(xì)胞2 pfu的EV71，F(xiàn)luo-3標(biāo)記胞質(zhì)鈣離子(1∶1000處理30 min)。PBS洗3次，2.5%的胰酶消化細(xì)胞，500 r/min離心5 min，PBS洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min，1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗3次，細(xì)胞重懸于500 μL PBS，流式細(xì)胞儀檢測(cè)(BD FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀)。

1.2.2 激光共聚焦技術(shù)觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度及分布的變化

將HeLa分至有蓋玻片的48孔板中，細(xì)胞貼壁12 h，EV71感染細(xì)胞8 h，用Fluo-3和ER traker標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。避光的情況下用PBS洗3次，每次10 min。制片，激光共聚焦顯微鏡觀察(Leica SP2雙掃描模式激光共聚焦顯微鏡)。

1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子檢測(cè)

1.3.1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子變化

DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，鋪平板12 h。感染前換無(wú)鈣DMEM。EV71感染，標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)鈣離子，PBS洗3遍，洗去殘留的染料。2.5%的胰酶消化，收集細(xì)胞并500 r/min離心5 min，PBS洗3遍，收樣，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3遍，細(xì)胞用500 μL PBS重懸，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)(BD FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀)。

U251細(xì)胞感染病毒，感染后用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑盒處理細(xì)胞(具體的操作方法根據(jù)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)。避光條件下PBS沖洗3遍，洗去殘留的染料。2.5%的胰酶進(jìn)行消化，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min，1000 r/min離心5 min，PBS洗3遍，500 μL PBS重懸細(xì)胞，立即通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)(BD FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀)。

1.3.2 激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的熒光強(qiáng)度

將HeLa分到有蓋玻片的48孔板中，細(xì)胞貼壁12 h，使EV71感染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑盒處理細(xì)胞，用ER traker染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以此作為指示劑。在4%多聚甲醛中室溫固定30 min，避光情況下用PBS洗3遍，每次10 min。制片，激光共聚焦顯微鏡下觀察(Leica SP2雙掃描模式激光共聚焦顯微鏡)。

1.4 檢測(cè)線粒體鈣離子濃度變化

將鋪平板12 h的Hela細(xì)胞感染病毒，用X-rhod-1處理細(xì)胞(具體的操作方法根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)。PBS沖洗3遍，洗去殘留的染料。2.5%的胰酶消化，PBS沖洗3遍，500 μL PBS重懸，立即通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)(BD FACSAria流式細(xì)胞分選/分析儀)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定

圖1 EV71感染對(duì)細(xì)胞胞質(zhì)鈣離子的影響

A是感染前后細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度變化的流式檢測(cè)圖，黑線紫色區(qū)為對(duì)照組；綠線為實(shí)驗(yàn)組。B和C是利用confocal技術(shù)檢測(cè)對(duì)比感染前后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度變化。其中綠色代表細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度，紅色代表內(nèi)質(zhì)網(wǎng) B是實(shí)驗(yàn)組；C是對(duì)照組。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，病毒感染8 h后，感染組Flow-3熒光信號(hào)較未感染組明顯右移(圖1A)。表明病毒感染組細(xì)胞胞質(zhì)鈣離子濃度顯著升高。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，我們將細(xì)胞培養(yǎng)于玻片上，并進(jìn)行Fluo-3染色。激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞感染EV71后，代表胞質(zhì)鈣離子的綠色熒光的強(qiáng)度明顯高于未感染組(圖1B, 1C)。表明EV71感染后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度顯著升高。

圖2 EV71感染對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的影響

A為無(wú)鈣培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細(xì)胞感染與不感染EV71情況下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度變化圖，其中綠線是對(duì)照組，黑線紫色區(qū)域是實(shí)驗(yàn)組。B是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)U251細(xì)胞系感染前后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度，其中黑線是實(shí)驗(yàn)組，綠線是對(duì)照組。C和D是感染和不感染病毒細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子confocal圖，其中紅色的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，綠色的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子 C是實(shí)驗(yàn)組。D是對(duì)照組。

2.2 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度變化的檢測(cè)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最主要的鈣離子貯存細(xì)胞器，而小核糖核酸病毒科病毒感染細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的重排和改變[4]。 因此，我們猜測(cè)EV71感染細(xì)胞后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的變化可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的迅速釋放有關(guān)。通過(guò)利用無(wú)鈣培養(yǎng)基培養(yǎng)EV71感染Hela細(xì)胞，觀察胞質(zhì)鈣離子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)鈣離子變化情況。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，感染組Flow-3熒光信號(hào)較未感染組明顯右移。說(shuō)明EV71在感染后胞質(zhì)鈣離子的濃度升高 (圖2A)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在感染了EV71的細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的共定位和未感染的EV71對(duì)照組細(xì)胞相比明顯減少。此外，未感染EV71細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子濃度要遠(yuǎn)高于EV71感染細(xì)胞組(綠色代表內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子，紅色代表內(nèi)質(zhì)網(wǎng))，見(jiàn)圖2C和D。我們又利用流式細(xì)胞技術(shù)在U251細(xì)胞系檢測(cè)了細(xì)胞在EV71感染后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子變化。結(jié)果顯示U251細(xì)胞在感染了病毒以后細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的峰圖明顯左移，說(shuō)明EV71感染后細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子濃度與未感染對(duì)照組相比明顯減少(圖2B)。

2.3 線粒體鈣離子的檢測(cè)

上述結(jié)果表明，EV71感染細(xì)胞后引起胞質(zhì)鈣離子升高與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放有關(guān)。我們進(jìn)一步推測(cè)胞質(zhì)中增加的鈣離子可能有一部分被細(xì)胞線粒體吸收，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此我們又利用X-rhod-1檢測(cè)了感染病毒后的細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子的濃度變化情況，為進(jìn)一步研究EV71是否會(huì)通過(guò)鈣離子變化引起細(xì)胞凋亡提供一定的基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，同未感染的對(duì)照細(xì)胞相比較，感染EV71的細(xì)胞中線粒體內(nèi)鈣離子的濃度明顯升高 (圖3)。這一結(jié)果說(shuō)明EV71感染細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子可能被線粒體所吸收，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)鈣離子濃度的上調(diào)。

Fig 3 線粒體鈣離子濃度流式檢測(cè)圖

注：右邊綠色的峰代表感染以后細(xì)胞線粒體鈣離子的濃度。

3 討論

鈣離子通路是細(xì)胞內(nèi)重要的通路之一，該通路的變化會(huì)引起細(xì)胞凋亡，細(xì)胞膜的融合，細(xì)胞收縮，細(xì)胞內(nèi)酶的激活和細(xì)胞周期調(diào)控等變化，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的紊亂能引起機(jī)體多種病變例如，細(xì)胞的癌變，心血管疾病，骨骼疾病以及其他神經(jīng)性疾病等等[7]。細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化還能夠引起柯薩奇B3病毒復(fù)制的延遲[5]。線粒體鈣離子升高后會(huì)破壞原有的線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體通透孔開(kāi)放，釋放線粒體內(nèi)的某些蛋白，從而引起細(xì)胞凋亡[6]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)重要的鈣庫(kù)，其鈣離子的急劇變化也會(huì)引起細(xì)胞的凋亡[8-9]。

能夠引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高的因素有許多，除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)在病理、應(yīng)激和生理?xiàng)l件的應(yīng)答下釋放鈣離子以外，細(xì)胞質(zhì)膜上的鈣離子通道也能將細(xì)胞外鈣離子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)[7,10,14-15]。我們研究發(fā)現(xiàn)EV71感染細(xì)胞以后，首先引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這一重要鈣庫(kù)內(nèi)鈣離子的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的升高，由此引起細(xì)胞線粒體周?chē)h(huán)境的鈣離子濃度升高，導(dǎo)致線粒體吸收細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子，使線粒體內(nèi)鈣離子濃度升高。病毒在感染細(xì)胞的過(guò)程中，為了有利于自身的復(fù)制會(huì)產(chǎn)生一些抵抗宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)和凋亡系統(tǒng)的途徑[11]?，F(xiàn)已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放可以保護(hù)細(xì)胞免受C2-ceramide誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而EV71的2B蛋白可以抑制宿主細(xì)胞的凋亡，因此鈣離子在這個(gè)過(guò)程中是否起作用還需要做進(jìn)一步的研究和探索[6,8-9]。此外，根據(jù)我們的研究還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子于細(xì)胞質(zhì)后，又被線粒體所吸收，但是線粒體內(nèi)鈣離子的升高會(huì)引起細(xì)胞凋亡[6,18]，EV71引起的線粒體鈣離子升高是否與細(xì)胞的凋亡有關(guān)也需要進(jìn)一步研究和探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EV71感染會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的增加，而這一增加是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子釋放引起，進(jìn)而引起線粒體內(nèi)鈣離子濃度的升高。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究EV71能否通過(guò)鈣離子引起細(xì)胞凋亡，以及病毒粒子的釋放提供理論基礎(chǔ)。

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