彭 維，吳萬征，鄒 威，朱芳繪，王永剛，王建壯，郭 靜

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001；3.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；4.廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303)

紅珠膠囊是中山大學(xué)研制的中藥五類新藥，具有止咳、化痰的作用，其內(nèi)容物為化橘紅有效部位。筆者采用RRLC-ESI-MS/MS 技術(shù)，首次鑒定了該藥中的9個(gè)成分，闡明了其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200SL RRLC-6410QQQ液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)； BP211D電子分析天平(瑞士沙多利斯公司)；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

柚皮苷(供含量測(cè)定用，中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110722-200309)；新北美圣草苷(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：1326322，純度98.6%)；野漆樹苷(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：023H0743，純度99.0%)；橙皮內(nèi)酯水合物(云南西力生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào):5875-49-0-BBP00486，純度>95%)；櫻桃苷(加拿大ChromaDex公司，純度>98%)；7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羥基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素(自制，經(jīng)UV、IR、MS、NMR譜確證)；柚皮素(Sigma公司，貨號(hào)：N5893-1g，批號(hào)：035K1316,純度97.5%)。紅珠膠囊由中山大學(xué)廣州現(xiàn)代中藥質(zhì)量研究開發(fā)中心研制，委托廣東環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)20120501)。

甲醇(色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司)，甲酸(色譜純，美國Sigma公司)，水為超純水。

2 方 法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取新北美圣草苷、櫻桃苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內(nèi)酯水合物、7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羥基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素、柚皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含新北美圣草苷、櫻桃苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內(nèi)酯水合物、7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羥基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素、柚皮素各0.1 mg的混合對(duì)照品貯備液，4 ℃冷藏備用。使用時(shí)將貯備液稀釋100倍作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中,加甲醇約70 mL，超聲處理(功率360 W，頻率35 kHz)30 min，放冷至室溫,用φ=50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液，適當(dāng)稀釋，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 RRLC-ESI-MS/MS分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.5 μm，150 mm×3.0 mm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為甲醇-甲酸溶液(pH=3.0)，0～50 min：甲醇(φ)：30%→60%，甲酸溶液(φ)：70%→40%；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源：ESI，正、負(fù)離子模式檢測(cè)，干燥氮?dú)鉁囟?50 ℃，流量12.0 L/min，霧化氣壓力40 psi，毛細(xì)管電壓4 000 V，掃描質(zhì)量范圍m/z100～1 500。

3 結(jié) 果

樣品在RRLC-MS/MS正模式和負(fù)模式下進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1、表1。

圖 1 紅珠膠囊正模式(A)和負(fù)模式(B)的總離子流圖Fig.1 Total Ion current of positive mode(A) and negative mode(B) of Hongzhu Capsule

通過紫外光譜特征、質(zhì)譜中分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量匹配、保留時(shí)間對(duì)比、結(jié)合文獻(xiàn)查閱等信息，以及與對(duì)照品比較，確證和指認(rèn)了紅珠膠囊中9個(gè)成分，具體如下。

3.1 新北美圣草苷(Neoeriocitrin)

檢測(cè)到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z597.5，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得到m/z289.1，為糖苷鍵斷裂產(chǎn)生。[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z595.0，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得到m/z459.3為C環(huán)進(jìn)行RDA裂解，然后丟失一個(gè)羰基產(chǎn)生；m/z287.0為糖苷鍵斷裂產(chǎn)生；m/z150.8為糖苷鍵斷裂后C環(huán)進(jìn)行RDA裂解再丟失一個(gè)羰基所產(chǎn)生的。在液質(zhì)聯(lián)用中，與對(duì)照品的相對(duì)保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致，經(jīng)與文獻(xiàn)[1-2]比對(duì)，確證該化合物為新北美圣草苷，分子式為C27H32O15。

3.2 櫻桃苷(Prunin)

檢測(cè)到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z435.4。[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z433.0，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得到m/z271.0及m/z150.7。其中m/z271.0為糖苷鍵斷裂產(chǎn)生，m/z150.7為糖苷鍵斷裂后C環(huán)進(jìn)行RDA裂解，然后丟失一個(gè)H所得。在液質(zhì)聯(lián)用中，與對(duì)照品的保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致，經(jīng)文獻(xiàn)[2-3]比對(duì)，確證該化合物為櫻桃苷，分子式為C21H22O10。

表1 紅珠膠囊化學(xué)成分分析(正模式和負(fù)模式)Table 1 Chemical Constituent Analysis in Hongzhu Capsule(positive and negative modes)

注：7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羥基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素(Melitidin)

3.3 柚皮苷(Naringin)

檢測(cè)到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z 581.3。[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z579.0，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得到m/z459.0為C環(huán)進(jìn)行RDA裂解丟失苯酚基和一個(gè)羰基產(chǎn)生；m/z271.1為柚皮苷配基-7-O-葡糖苷的糖苷鍵斷裂產(chǎn)生。在液質(zhì)聯(lián)用中，與對(duì)照品的保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致，經(jīng)文獻(xiàn)[1-3]比對(duì)，確證該化合物為柚皮苷，分子式為C27H32O14。

3.4 忍冬苷(Lonicerin)

檢測(cè)到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z595.0。[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z593.0，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得到m/z284.8為忍冬苷的糖苷鍵斷裂產(chǎn)生的；m/z151.0為糖苷鍵斷裂后C環(huán)進(jìn)行RDA裂解所產(chǎn)生的。在液質(zhì)聯(lián)用中，根據(jù)分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為與文獻(xiàn)[4]比對(duì)，指認(rèn)該化合物為忍冬苷，分子式為C27H30O15。

3.5 野漆樹苷(Rhoifolin)

檢測(cè)到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z579.0。[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z577.1，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得到m/z269.1為野漆樹苷的糖苷鍵斷裂產(chǎn)生。在液質(zhì)聯(lián)用中，與對(duì)照品的保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致，經(jīng)文獻(xiàn)[1-3]比對(duì)，確證該化合物為野漆樹苷，分子式為C27H30O14。

3.6 橙皮內(nèi)酯水合物(Meranzin hydrate)

檢測(cè)到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z278.9，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得到m/z261.0，m/z243.2，m/z189.1及m/z131.0。m/z261.0為橙皮內(nèi)酯，支鏈斷裂形成苯駢呋喃離子m/z189.1，丟失一個(gè)甲氧基和一個(gè)羰基產(chǎn)生m/z131.0。在液質(zhì)聯(lián)用中，與對(duì)照品的保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致，經(jīng)文獻(xiàn)[3,5-6]比對(duì)，確證該化合物為橙皮內(nèi)酯水合物，分子式為C15H18O5。

3.7 7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羥基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素(Melitidin)

檢測(cè)到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z724.2。[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z722.7，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得到m/z620.8、m/z578.9及m/z270.9，其中m/z620.8為酯鍵斷裂產(chǎn)生，再丟失一個(gè)乙?；a(chǎn)生m/z578.9， Melitidin的酯鍵、糖苷鍵斷裂形成柚皮素m/z270.9。在液質(zhì)聯(lián)用中，與Melitidin的保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致，經(jīng)文獻(xiàn)[1]比對(duì)，確證該化合物為Melitidin，分子式為C33H40O18。

3.8 柚皮素(Naringenin)

檢測(cè)到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z273.2。[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z271.0，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得m/z150.9及m/z106.9。其中m/z150.9為C環(huán)進(jìn)行RDA裂解丟失苯酚基和一個(gè)羰基產(chǎn)生，m/z106.9為A環(huán)斷裂、C環(huán)RDA裂解產(chǎn)生。在液質(zhì)聯(lián)用中，與對(duì)照品的保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致，經(jīng)文獻(xiàn)[1,3]比對(duì)，確證該化合物為柚皮素，分子式為C15H12O5。

3.9 異橙皮內(nèi)酯(Isomeranzin)

檢測(cè)到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z261.0，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描(PI)，得到m/z243.1，m/z189.0及m/z131.2。支鏈斷裂形成苯駢呋喃離子m/z189.0，丟失一個(gè)甲氧基和一個(gè)羰基產(chǎn)生香豆素類化合物的特征離子m/z 131.2。在液質(zhì)聯(lián)用中，根據(jù)保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為，經(jīng)文獻(xiàn)[3,5-6]比對(duì)，指認(rèn)該化合物為異橙皮內(nèi)酯，分子式為C15H16O4。

4 討 論

經(jīng)過RRLC-MS/MS分析，確證和指認(rèn)了紅珠膠囊中7個(gè)黃酮類成分(新北美圣草苷、櫻桃苷、柚皮苷、忍冬苷、野漆樹苷、Melitidin、柚皮素)和2個(gè)香豆素類成分(橙皮內(nèi)酯水合物、異橙皮內(nèi)酯)。本研究揭示了紅珠膠囊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，有利于監(jiān)控該藥的質(zhì)量[7]。

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