李文宏，王 閃，張永強，宋 浩，向忠遠，張忠智,徐飛艷

(1.中國石油長慶油田分公司勘探開發(fā)研究院，陜西 西安 710018；2.低滲透油氣田勘探開發(fā)國家工程實驗室，陜西 西安 710018；3.中國石油大學(xué)(北京)化學(xué)工程學(xué)院，北京 102249)

油藏內(nèi)源微生物群落是在油田開發(fā)注水過程中隨注水進入油藏，并且在一定時期內(nèi)在數(shù)量和種類上都能夠保持相對穩(wěn)定的微生物群落，這些微生物不僅代謝類型多，而且變異性大，在微生物生態(tài)系統(tǒng)中占有非常重要的位置。大多數(shù)油藏環(huán)境是典型的極端環(huán)境，具有厭氧、高溫、高壓和高礦化度等特點，極端的儲層環(huán)境造就了獨特的油藏微生物生態(tài)系統(tǒng)，形成了豐富且有特色的油藏極端微生物資源和基因資源[1-2]。由于菌種的來源不同，內(nèi)源微生物采油技術(shù)同外源微生物采油技術(shù)相比不僅不存在菌種適應(yīng)性的問題，而且工藝簡單、投資少、微生物代謝活性高[3-7]，具有較大的優(yōu)勢。激活油藏中的內(nèi)源微生物是進行內(nèi)源微生物采油的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是進行內(nèi)源微生物采油的基礎(chǔ)，因而利用合適的激活體系選擇性地激活油藏中有益的采油功能菌、抑制有害菌，是內(nèi)源微生物采油研究的重要課題[8]，其中激活體系的選擇對于激活效果至關(guān)重要。

由于油藏中氮、磷等營養(yǎng)元素一般極度缺乏，國外通常采用向地層注入添加了氮、磷等的注入水的方法來激活內(nèi)源微生物。然而研究表明，在油藏的極端環(huán)境下僅補充氮、磷是不夠的，適當補充以糖類為主的外加碳源是提高微生物驅(qū)油效果的重要方法[9]。目前已報道的常用碳源有糖蜜、玉米糖、玉米發(fā)酵廢水、麥芽糊精、乳酸生產(chǎn)廢水[10-11]等。

作者在此針對靖安油田五里灣一區(qū)油藏高鹽和低滲透的特點，對其內(nèi)源微生物進行普查和分析，在初步篩選營養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上進行碳源、氮源、磷源的篩選，然后進一步優(yōu)化它們的用量，旨在篩選出適合五里灣一區(qū)高鹽低滲儲層的激活體系，從產(chǎn)氣量、菌濃和有益菌數(shù)量的變化等方面評價五里灣一區(qū)油藏內(nèi)源微生物驅(qū)油提高原油采收率的潛力。

1 實驗

1.1 實驗區(qū)塊概況

靖安油田五里灣一區(qū)含油層系為三疊系延長組6油層組，油層埋深1 210 m，平均孔隙度為13%，平均滲透率為1.81 mD，油層溫度54 ℃。地層水礦化度為80 506 mg·L-1，水型為CaCl2，地層原油黏度2.0 mPa·s，屬于低滲透、高鹽油藏。1996年投入開發(fā)，1997年采用反九點法面積注水井網(wǎng)開發(fā)。該區(qū)平均單井產(chǎn)油量為4.6 t·d-1。該區(qū)所有生產(chǎn)井均為壓裂后投產(chǎn)，但是壓裂后的油層含水率上升較快，難以保持穩(wěn)產(chǎn)。開發(fā)過程的主要矛盾為水驅(qū)儲量動用程度呈下降趨勢和見水油井含水上升較快，需要新的技術(shù)保持穩(wěn)產(chǎn)。

1.2 材料與儀器

樣品來源：靖安油田五里灣一區(qū)油井的采出液。

高壓滅菌鍋、恒溫搖床、超凈工作臺、分析天平、張力儀、離心機等。

1.3 方法

1.3.1 油藏內(nèi)源微生物分布的調(diào)查

油藏內(nèi)源微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)查采用中石油廊坊分院推薦的“油藏本源菌常規(guī)檢測推薦方法試劑瓶法”。根據(jù)油藏井網(wǎng)和生產(chǎn)特點，在油藏內(nèi)選取有代表性的10口油井取樣營養(yǎng)物質(zhì)，分析產(chǎn)出液中內(nèi)源微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量。

1.3.2 激活體系的碳源、氮源、磷源的單因素實驗篩選

碳源包括糖蜜和玉米漿干粉；氮源包括NaNO3、KNO3、NH4NO3和蛋白胨；磷源包括酵母粉、KH2PO4和NaH2PO4。

碳源篩選實驗中，碳源的添加量為0.5%，氮源為0.2%NaNO3，磷源為0.1%酵母粉；氮源篩選實驗中，碳源為1%糖蜜，磷源為0.1%酵母粉；因油層采出液為CaCl2水型，其中含有大量的Ca2+，在進行磷源的篩選時必須考慮是否會產(chǎn)生沉淀，為此，設(shè)置了加入螯合劑(EDTANa2)的對照組；磷源篩選實驗中碳源為1%糖蜜，氮源為0.2%NaNO3。

激活實驗是在100 mL醫(yī)用小瓶中加入設(shè)計好的激活體系成分，再加入2%的原油，121 ℃高溫高壓滅菌后加入50 mL采出液，用已滅菌的膠塞密封(限氧-厭氧)，置于45 ℃(產(chǎn)出水溫度)的恒溫搖床150 r·min-1培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液10 000 r·min-1、4 ℃下離心10 min，去除上清液，用等體積的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸，以PBS緩沖溶液作為對照，測定其OD600值，以3 d產(chǎn)氣量和菌濃OD600值作為評價指標。每組實驗做3個平行。

1.3.3 激活體系的優(yōu)化

1.3.3.1 PB實驗

為了防止其它因素造成的顯著性影響，Plackett-Burman(PB)實驗設(shè)計[12]中，兩水平間的差值不能過大[13]?；趩我蛩貙嶒灲Y(jié)果，利用Design Expert 8.0.7設(shè)計軟件，以1.5倍步長設(shè)計PB實驗，以產(chǎn)氣量作為響應(yīng)值。利用設(shè)計Design expert 8.0.7設(shè)計軟件進行實驗結(jié)果的方差、顯著性等分析，找出對產(chǎn)氣量影響最為顯著的因素。

1.3.3.2 最陡爬坡實驗

針對PB實驗確定的顯著因素，設(shè)計合適步長進行最陡爬坡實驗以得到最大響應(yīng)值，以作為響應(yīng)面實驗中中心組合設(shè)計的中心點。

1.3.3.3 響應(yīng)面實驗

通過PB實驗得到了激活體系中影響顯著的因素，為了分析各因素之間的交互作用，得到最優(yōu)激活體系配方并建立其應(yīng)用模型，利用Design Expert 8.0.7設(shè)計軟件設(shè)計了響應(yīng)面實驗。在中心組合實驗(central composite experiment,CCD)中同樣取一個低水平和一個高水平，盡量使最陡爬坡實驗中最佳組合的因素的含量處于響應(yīng)面設(shè)計中高低水平的中心。

2 結(jié)果與討論

2.1 油藏內(nèi)源微生物的分布(表1)

表1油藏內(nèi)源微生物的類型與數(shù)量/(CFU·mL-1)

Tab.1 The type and number of indigenous microorganisms in reservoir/(CFU·mL-1)

注：NRB為硝酸鹽還原菌；FMB為發(fā)酵菌；HOB為烴氧化菌；SRB為硫酸鹽還原菌；TGB為腐生菌。

由表1可見，靖安油田五里灣一區(qū)10口油井的油藏中有不同類型且數(shù)量較多的微生物，生物潛力較大。只要添加合適的激活劑，最大限度地激活油藏中的有益菌，抑制有害菌，就具有實施內(nèi)源微生物驅(qū)油的可能。

2.2 碳源、氮源、磷源的篩選和優(yōu)化

微生物的代謝產(chǎn)氣是一個相當復(fù)雜的生物化學(xué)過程，產(chǎn)氣量的多少和氣體成分不僅與細菌種類有關(guān)，還與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分密切相關(guān)。營養(yǎng)成分篩選的單因素實驗方案和結(jié)果見表2。

表2營養(yǎng)成分的單因素實驗篩選方案及結(jié)果

Tab.2 The program and results of single factor experiment for screening of nutritional components

2.2.1 碳源的篩選與優(yōu)化

由表2可見，糖蜜的產(chǎn)氣效果及對地層微生物激活效果要好于玉米漿干粉。實驗發(fā)現(xiàn)以玉米漿干粉為碳源進行激活時產(chǎn)生了大量的硫化氫氣體，推測玉米漿干粉激活了硫酸鹽還原菌，故玉米漿干粉不可用。確定糖蜜為激活體系的適宜碳源。

進一步以0.2%NaNO3為氮源、0.1%酵母粉為磷源，測定不同濃度糖蜜為碳源時的3 d產(chǎn)氣量和OD600值，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The results of optimization of carbon source concentration

由圖1可見，不加糖蜜時產(chǎn)氣量和OD600值都很低，隨著糖蜜濃度的增大，產(chǎn)氣量和OD600值均相應(yīng)上升，當糖蜜的濃度達到1.2%時，產(chǎn)氣量達到94 mL、OD600值也達到最高；此后再增大糖蜜濃度，產(chǎn)氣量和OD600值反而下降。這說明營養(yǎng)過度缺乏或過剩都會抑制微生物的生長，進而影響到產(chǎn)氣量，因此，將糖蜜的濃度初步定為1.2%。

2.2.2 氮源的篩選與優(yōu)化

由表2可見，以NaNO3、KNO3、NH4NO3為氮源時，產(chǎn)氣量相近，其中以NaNO3為氮源時菌濃最大，OD600值達到1.933；相比其它3種氮源，蛋白胨的產(chǎn)氣量和OD600值均不理想。故確定NaNO3作為激活體系的適宜氮源。進一步以1%糖蜜為碳源、0.1%酵母粉為磷源，測定不同濃度NaNO3為氮源時的3 d產(chǎn)氣量和OD600值，結(jié)果見圖2。

圖2 氮源濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 The results of optimization of nitrogen source concentration

由圖2可見，在NaNO3濃度很低時，隨著NaNO3濃度的增大，產(chǎn)氣量和OD600值均上升；當NaNO3濃度達到0.25%時，產(chǎn)氣量和OD600值同時達到最大；此后再增大NaNO3濃度，產(chǎn)氣量和OD600值反而下降。因此，將NaNO3的濃度初步定為0.25%。

2.2.3 磷源的篩選與優(yōu)化

由表2可見，以有機磷源酵母粉為磷源時，產(chǎn)氣量和OD600值與無機磷源KH2PO4、NaH2PO4相差不大。但是由于該油藏采出液中含有大量Ca2+，加入無機磷源會有沉淀生成，雖然加入螯合劑EDTANa2后，沉淀大大減少，但是其產(chǎn)氣量和OD600值卻不理想，推測是由于EDTANa2抑制了微生物的生長。因此，確定酵母粉作為激活體系的適宜磷源。

進一步以1%糖蜜為碳源、0.2%NaNO3為氮源，測定不同濃度酵母粉為磷源時的3 d產(chǎn)氣量和OD600值，結(jié)果見圖3。

圖3 磷源濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.3 The results of optimization of phosphorous source concentration

由圖3可見，不添加酵母粉時，產(chǎn)氣量和OD600值都很低；隨著酵母粉濃度的增大，產(chǎn)氣量和OD600值均明顯上升；當酵母粉濃度達到0.08%時，產(chǎn)氣量和OD600值同時達到最大；此后繼續(xù)增大酵母粉的濃度，產(chǎn)氣量明顯下降，而OD600值變化不大?？梢娊湍阜蹖τ谖⑸锏纳L是必需的，但是只要微量的酵母粉就可以滿足微生物的需要。因此，將酵母粉的濃度初步定為0.08%。

2.3 PB實驗結(jié)果與分析

PB實驗設(shè)計及各變量的響應(yīng)結(jié)果見表3，實驗結(jié)果分析見表4。

表3Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

Tab.3 Design and results of Plackett-Burman experiment

表4Plackett-Burman實驗結(jié)果分析

Tab.4 Analysis of Plackett-Burman experiment results

變量系數(shù)(coefficient)絕對值的大小代表了該變量對實驗結(jié)果的影響。絕對值越大，表明該變量對結(jié)果的影響越大，變量的P值代表了該變量導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)不符合預(yù)測情況的概率，即該變量的顯著程度。P值越小，表明該變量對預(yù)測結(jié)果的影響越顯著。由表4可見，糖蜜濃度、酵母粉濃度和FeSO4濃度3個因素對產(chǎn)氣量的影響最為顯著(P<0.05)，且糖蜜濃度表現(xiàn)為正效應(yīng)，酵母粉濃度和FeSO4濃度表現(xiàn)為負效應(yīng)，即增大糖蜜的濃度、減小酵母粉和FeSO4的濃度有利于提高激活過程中地層水中微生物的產(chǎn)氣量。因此，選擇糖蜜、酵母粉和FeSO43個因素進一步優(yōu)化分析，通過最陡爬坡實驗確定產(chǎn)氣量最佳點的范圍。

2.4 最陡爬坡實驗結(jié)果(表5)

由表5可見，第5組實驗產(chǎn)氣量最高，且其前后兩組的產(chǎn)氣量也相當高，因此選擇第5組因素的濃度作為響應(yīng)面優(yōu)化實驗中心組合設(shè)計的中心點。

表5最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果

Tab.5Designandresultsofsteepestascentpathexperiment

實驗號糖蜜濃度/%酵母粉濃度/%FeSO4濃度/%產(chǎn)氣量/mL10.650.100.00403620.800.090.00355330.950.080.00306741.100.070.00258251.250.060.002010861.400.050.00159571.550.040.00108981.700.030.000588

2.5 中心組合設(shè)計實驗結(jié)果及響應(yīng)面分析

為考察糖蜜(A)、酵母粉(B)、FeSO4(C)3個因素間的交互作用，設(shè)計3因素3水平的中心組合實驗，共15組實驗。中心組合實驗的設(shè)計方案和結(jié)果見表6，回歸性分析見表7。

表6中心組合實驗設(shè)計方案及結(jié)果

Tab.6Designandresultsofcentralcompositeexperiment

實驗號A/%B/%C/%產(chǎn)氣量/mL11.00.040.00206021.50.040.00208531.00.080.00208041.50.080.00208851.00.060.00208261.50.060.00157271.00.060.00257381.50.060.00258391.250.040.001588101.250.080.001580111.250.040.002098121.250.080.002592131.250.060.0020113141.250.060.0025102151.250.060.0015108

由表7可見，在3個因素中，糖蜜濃度、FeSO4濃度對激活過程中微生物的產(chǎn)氣量影響是顯著的。

三維響應(yīng)面和等高線圖如圖4所示。

由圖4可見，3個等高線圖均未呈橢圓形，表明3個因素間的交互作用并不顯著，這與表7所示各因素交互作用的P值大于0.05的結(jié)論相一致。

通過中心組合實驗，獲得產(chǎn)氣量與糖蜜濃度、酵母粉濃度和FeSO4濃度之間的關(guān)系式為：

產(chǎn)氣量=105.23-14.13A+10.79B+30.26C-4.25AB+2.24AC+5.63BC-24.90A2-13.44B2-15.66C2

(1)

表7中心組合實驗回歸性分析

Tab.7Regressionanalysisofcentralcompositeexperiment

項系數(shù)平方和自由度均方F值P值/Prob>FModel-2549.569283.286.070.0306A-14.13252.261252.265.400.0676B10.79167.561167.563.390.1167C30.26521.201521.2011.170.0205AB-4.2572.25172.251.550.2686BC2.2411.44111.440.250.6416AC5.6372.25172.251.550.2686A2-24.901710.8111710.8136.650.0018B2-14.44575.441575.4412.330.0171C2-15.66569.751569.7512.210.0174

通過響應(yīng)面圖的凸點大致確定2個變量的優(yōu)化值范圍，對式(1)求3個變量的一階偏導(dǎo)，得出優(yōu)化值依次為：糖蜜濃度1.28%、酵母粉濃度0.058%、FeSO4濃度0.0019%。因此，確定激活體系組分為：糖蜜1.28%、NaNO30.25%、酵母粉0.058%、FeSO40.0019%、MnSO4·H2O 0.0001%。

2.6 驗證實驗

對所得激活體系優(yōu)化結(jié)果進行驗證實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活培養(yǎng)至第4 d時，菌濃達2×108CFU·mL-1，且有害菌的數(shù)量得到有效抑制；表面張力降至50 mN·m-1以下；產(chǎn)氣量最高達103 mL，較未添加激活體系時的產(chǎn)氣量大幅提高，說明這個區(qū)塊具有較大的內(nèi)源微生物驅(qū)油潛力。

3 結(jié)論

在已知靖安五里灣一區(qū)理化條件的基礎(chǔ)上，利用試劑瓶法對其內(nèi)源微生物的群落結(jié)構(gòu)進行了普查，并針對該區(qū)塊篩選出了一套激活體系，對其內(nèi)源微生物驅(qū)油潛力進行了評價，研究表明：

1)靖安油田五里灣一區(qū)10口油井的油藏中含有不同類型且數(shù)量較多的有益微生物。

2)通過營養(yǎng)成分的篩選及優(yōu)化單因素實驗，確定了適合該區(qū)塊的碳源糖蜜、氮源NaNO3、磷源酵母粉，并對其濃度進行了初步的優(yōu)化。

3)采用PB實驗、最陡爬坡實驗和響應(yīng)面法對影響產(chǎn)氣量的主要因素進行了優(yōu)化，確定最佳激活體系為：糖蜜1.28%、NaNO30.25%、酵母粉0.058%、FeSO40.0019%、MnSO4·H2O 0.0001%。該激活體系能夠很好地激活油藏中的內(nèi)源微生物，激活后菌濃和產(chǎn)氣量都有大幅度的增加，表面張力顯著降低，有害菌得到有效抑制。說明靖安油田五里灣一區(qū)油藏具有較大的內(nèi)源微生物驅(qū)油的潛力。

圖4 激活體系中產(chǎn)氣量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surfaces and contour lines for gas production of stimulation system

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