孫鳳俊，薛建華，呂小青，張佳誼

(北京奶牛中心 科研中心，北京 延慶 102100)

卵泡的發(fā)生和發(fā)育不僅受垂體性腺軸調(diào)節(jié)，與FSH緊密相關(guān)，還受卵巢內(nèi)一些因子的自分泌和旁分泌影響。這些因子主要為轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factors，TGF)超家族成員，包括顆粒細(xì)胞來源的抗苗勒氏管激素(AMH)、顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞來源的抑制素和激活素以及卵母細(xì)胞來源的生長分化因子-9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-15)等等。其中抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)引起了人們的研究興趣，AMH又稱苗勒管抑制物質(zhì)(mullerian inhibitory substance，MIS)，只在性腺產(chǎn)生，表達(dá)于從初級卵泡到小竇卵泡的顆粒細(xì)胞中，在調(diào)控卵泡生長和發(fā)育中起到了重要的作用。本文就AMH的生理作用及其在牛超數(shù)排卵供體牛選擇上的應(yīng)用作一綜述。

1 AMH在生理性卵泡形成中的作用

1.1 AMH及其受體在生理性卵泡發(fā)育中的表達(dá)

在鼠胚卵巢中未檢出AMH，但生后4 d即可以在卵巢顆粒細(xì)胞中檢測到表達(dá)，這和初級卵泡開始生長的時間一致[1]。在對鼠的研究中，AMH表達(dá)于早期生長卵泡、竇前卵泡和小竇卵泡的顆粒細(xì)胞中，而在始基卵泡、大的竇卵泡、閉鎖卵泡和卵母細(xì)胞中均無表達(dá)[2]。在人類卵巢組織研究中，AMH在36周齡的胎兒卵巢中開始有表達(dá)[3]，在始基卵泡上無表達(dá)，在74%的初級卵泡的顆粒細(xì)胞上弱表達(dá)，在次級卵泡、竇前卵泡和4 mm的小竇卵泡中強(qiáng)表達(dá)，而在較大的竇卵泡(4～8 mm)中，AMH表達(dá)逐漸消失，在>8 mm的卵泡中幾乎無表達(dá)[4]。人的小竇卵泡(3～8 mm)卵泡液中的AMH是排卵前卵泡的3倍[5]。目前，對AMH受體的研究尚未發(fā)現(xiàn)始基卵泡上的表達(dá)，故推測AMH可能不直接作用于始基卵泡。AMH型受體在小的生長卵泡的顆粒細(xì)胞和卵泡內(nèi)膜細(xì)胞上表達(dá)，在較大的竇卵泡和排卵前卵泡的顆粒細(xì)胞上無表達(dá)，而在較大的竇卵泡和早期閉鎖卵泡的卵泡膜細(xì)胞上仍繼續(xù)表達(dá)[2，6]。綜上，AMH及其受體主要在較小的生長卵泡上表達(dá)，這表明AMH主要在早期卵泡的形成中起作用。

1.2 AMH參與卵泡形成的兩次重要募集

卵泡形成要經(jīng)歷兩次重要募集：起始募集和周期募集。始基卵泡的顆粒細(xì)胞呈扁平形，轉(zhuǎn)化為初級卵泡的顆粒細(xì)胞呈立方形，此時AMH才開始產(chǎn)生。AMH由初級卵泡產(chǎn)生，通過旁分泌抑制卵泡從始基卵泡池進(jìn)入生長卵泡池，從而調(diào)控起始募集。長期表達(dá)AMH的轉(zhuǎn)基因小鼠，胎兒早期卵泡形成明顯減少，且很快消失，最終導(dǎo)致性腺發(fā)育異常，提示AMH可能抑制始基卵泡啟動，導(dǎo)致生長卵泡減少[7]。AMH基因敲除的小鼠，出生時始基卵泡池正常，25 d和4月齡時發(fā)現(xiàn)其卵巢含有比野生型更多的生長卵泡，并伴隨始基卵泡減少，13個月大時始基卵泡幾乎檢測不到，竇前和小竇卵泡的數(shù)量也減少。即在發(fā)情期開始前始基卵泡就開始大量募集，使始基卵泡池過早耗盡，發(fā)情周期過早結(jié)束。表明缺乏AMH導(dǎo)致始基卵泡大量募集，證實AMH抑制始基卵泡募集的作用[8]。AMH還參與了從生長卵泡到成熟卵泡的另一次重要募集——周期募集。Durlinger等的研究發(fā)現(xiàn)，AMH抑制FSH刺激的竇前卵泡生長，而且AMH缺陷鼠無論FSH高或低比野生型有更多卵泡生長[9]，表明AMH缺乏的卵泡對FSH更敏感。每個卵泡因AMH等因子表達(dá)不同，F(xiàn)SH閾值不同，竇前和小竇卵泡中AMH的表達(dá)差異，影響卵泡對FSH的反應(yīng)性，從而影響卵泡的選擇。AMH低表達(dá)的生長卵泡對FSH的反應(yīng)性高，即降低了FSH閾值，從而被選擇，繼續(xù)生長至下一周期排卵[2]。在正常人類卵巢中，>9 mm的卵泡AMH生成減少，可能這對優(yōu)勢卵泡的選擇是必需的[10]。直徑2～5 mm的竇卵泡中AMH生成較高，依賴FSH生長，AMH低的卵泡可能優(yōu)先超出FSH閾值被周期募集了，繼續(xù)生長至6～9 mm的卵泡，AMH生成減少。

2 牛血漿AMH在選擇胚胎供體牛上的應(yīng)用研究

超數(shù)排卵與胚胎移植(MOET)技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于牛育種中，然而，可用胚胎數(shù)量(即優(yōu)良胚胎，目前每頭超排供體獲得6枚)在過去20年時間里沒有顯著變化[11]。制約MOET技術(shù)發(fā)展的主要因素是供體牛對超排處理反應(yīng)存在較大的差異性[12]。

一直以來，人們探討通過各種方法來預(yù)測供體牛胚胎生產(chǎn)能力，用于選擇優(yōu)良供體。然而，到目前還沒有簡單而又行之有效的方法用于選擇優(yōu)良胚胎供體牛。最近，人們注意力都集中在抗苗勒氏管激素(AMH)為牛卵巢卵泡庫和卵泡超排處理反應(yīng)提供新的信息。最新研究結(jié)果表明，抗苗勒氏管激素(AMH)也叫穆勒氏管抑制素(MIS)，特別是小生長卵泡的顆粒細(xì)胞所表達(dá)的，是牛卵巢對促性腺激素反應(yīng)卵泡庫大小的一種內(nèi)分泌標(biāo)記物，可以幫助預(yù)測個體牛排卵反應(yīng)[13，14]。AMH在小有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá)高，而卵泡生長末期和閉鎖階段表達(dá)下降[15，16]。直徑在3～7 mm的卵泡群是超排處理的主要目標(biāo)，對血漿AMH濃度發(fā)揮顯著作用，并已經(jīng)提出處理前檢測AMH血漿水平有助于預(yù)測超排反應(yīng)[16]。在許多治療婦女不排卵性不孕癥的臨床研究中，已經(jīng)明確AMH也作為卵巢對FSH處理反應(yīng)的標(biāo)記物，其優(yōu)勢是不依賴于所處周期的階段，而且從周期到周期是可重復(fù)的[17～20]。

Danielle Monniaux等[13]通過測定血漿AMH濃度，探討預(yù)測超排供體母牛生產(chǎn)可用胚胎能力。在2004～2008年，研究人員對45頭奶牛的胚胎重復(fù)生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性研究分析。每頭胚胎供體，單獨(dú)采血用于AMH檢測。在第1次泌乳期采集血樣，不考慮母牛所處的發(fā)情周期是哪個階段，還要在胚胎生產(chǎn)開始之前數(shù)月進(jìn)行。對結(jié)果進(jìn)行分析，評估供體胚胎生產(chǎn)數(shù)量的可重復(fù)性，尋求可能遺傳的特性。研究分析AMH血漿測定值與胚胎采集數(shù)量或可移植胚胎數(shù)量之間的關(guān)系。

4年來，45頭供體超排處理240頭次，生產(chǎn)胚胎2 901枚，其中可用胚胎1 946枚。每頭供體牛采集的胚胎總數(shù)和可用胚胎數(shù)變化范圍較大，分別從1枚到50枚和0枚到37枚不等(平均數(shù)分別為12.08±0.55和8.11±0.40)。根據(jù)供體獲得可用胚胎能力(C)將供體牛分為兩組，頭均獲得可用胚胎數(shù)量最多定義為高產(chǎn)胚胎供體牛，并將高產(chǎn)胚胎供體牛(優(yōu)良胚胎供體；C>10；n=32)采集的胚胎(P<0.001)與低產(chǎn)胚胎供體牛(C<10；n=13)采集的胚胎進(jìn)行比較。然而，高產(chǎn)胚胎供體牛與低產(chǎn)胚胎供體牛之間可用胚胎率(即生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)胚胎的比例)沒有顯著差異(分別為68.6%和58.8%；P>0.05)。

分析血漿AMH含量與胚胎生產(chǎn)數(shù)量之間的關(guān)系，供體母牛血漿AMH含量與每頭供體平均獲胚胎數(shù)和最高胚胎數(shù)呈正相關(guān)(分別為r=0.49，P<0.001；和r=0.58，P<0.0001)。供體母牛血漿AMH含量100～200 pg/mL組和>200 pg/mL組胚胎生產(chǎn)數(shù)量高于血漿AMH含量<100 pg/mL組供體母牛(比較頭均獲胚胎數(shù)和最高胚胎數(shù)，對于AMH含量<100 pg/mL組與100～200 pg/mL組供體比較，P<0.05；對于AMH含量<100 pg/mL組與>200 pg/mL組供體比較，P<0.01)。

每頭供體平均獲可用胚胎數(shù)和最高可用胚胎數(shù)也與血漿AMH含量相關(guān)(r=0.32，P<0.05；r=0.38，P<0.01)。供體母牛血漿AMH含量100～200 pg/mL組和>200 pg/mL組可用胚胎數(shù)量高于血漿AMH含量<100 pg/mL組(比較頭均獲可用胚胎數(shù)和最高可用胚胎數(shù)，AMH含量<100 pg/mL組與100～200 pg/mL組和200 pg/mL組供體比較，P<0.05)。生產(chǎn)可用胚胎能力高的供體母牛血漿AMH含量是生產(chǎn)可用胚胎能力低的供體母牛血漿AMH含量的2倍(分別為190.1±21.3 pg/mL和93.2±17.2 pg/mL，P<0.01)。

3 應(yīng)用與展望

Danielle Monniaux等[13]的研究結(jié)果表明，根據(jù)AMH濃度有助于選擇獲得優(yōu)良可用胚胎的供體牛。在哺乳動物中，卵泡是AMH的獨(dú)有來源[18]。而且，在母牛中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，AMH是促性腺激素敏感的小有腔卵泡數(shù)量的可靠內(nèi)分泌標(biāo)記[16]。有報道，在女性中，血漿AMH濃度不依賴于月經(jīng)周期的階段，從周期到周期相對恒定[17～20]。此外，最近研究結(jié)果表明，奶牛個體血漿AMH濃度穩(wěn)定數(shù)月，這是每頭母牛長期特點(diǎn)[16]?？傊?，這些研究結(jié)果表明，血漿AMH濃度不表現(xiàn)重要變異性，說明AMH可以作為預(yù)測高產(chǎn)或低產(chǎn)胚胎能力供體的理想候選方法。

Danielle Monniaux等[13]的研究結(jié)果進(jìn)一步證明了AMH含量與超排后采集的胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)之間呈顯著相關(guān)。同時，供體母牛胚胎生產(chǎn)能力是可重復(fù)的，可能遺傳的性狀。而且，該研究結(jié)果為根據(jù)測定供體母牛血漿AMH含量確定具備生產(chǎn)可用胚胎潛在能力的供體提供簡單的預(yù)測方法。然而，需要進(jìn)一步的研究評估確定進(jìn)行血液檢測的最佳時間，并根據(jù)動物年齡、發(fā)情周期的階段、卵泡波和身體狀況、以及確定將用于選擇的優(yōu)良和較差胚胎供體的血漿AMH濃度臨界值。

隨著對AMH檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和在奶牛繁殖技術(shù)應(yīng)用的深入研究，檢測牛血漿AMH含量不斷成熟，并將廣泛應(yīng)用于優(yōu)良種牛胚胎供體的選擇，為胚胎移植技術(shù)發(fā)展發(fā)揮重要作用。

[1] Durlinger AL，Gruijters M J，Kramer P，et al.Anti-Mllerian hormone inhibit sinitiation of primordial follicle growth in the mouse ovary[J].Endocrinology，2002，143：1076-84.

[2] Baarends WM，Uilenbroek J T，Kramer P，et al.Anti-mllerian hormone and antimllerian hormone type II receptor messenger ribonucleic acid expression in rat ovaries during postnatald evelopment，the estrous cycle，and gonadotropin induced follicle growth [J].Endocrinology，1995，136：4951 -62.

[3] Rajpert D E，Jorgensen N，Graem N，et al.Expression of antimllerian hormone during normal and pathological gonadal development：association with differentiation of Sertoli and granulosa cells[J].J C lin EndocrinolM etab，1999，84：3836-44.

[4] Weenen C，Laven J S，Von Bergh A R，et al.Antimllerian hormone expression pattern in the human ovary：potentialim plication s for initial and cyclic follicle recruitment [J].Mol Hum Reprod，2004，10：77-83.

[5] Feyereisen E，Mendez Lozano DH，Taieb J，et al.Anti mllerian hormone：clinical insigh ts into a promising biomarker of ovarian follicular status[J].R eprod B iom ed On lin e，2006，12：695-703.

[6] Ingraham HA，Hirokawa Y，Roberts L M，et al.Autocrine and paracrine mllerian inhib iting substance hormone signaling in reproduction [J].Recent Prog H orm Res，2000，55：53-67；discuss ion 67-8.

[7] Behringer R R，Cate R L，F(xiàn)roelick G J，et al.Abnormal sexual development in transgenic mice chronically express ing mllerian inhib iting substance[J].Nature，1990，345：167-70.

[8] Durlinger A L，Kramer P，Karels B，et al.Control of primordial follicle recruitment by an ti-mllerian hormone in the mouse ovary[J].Endocrino logy，1999，140：5789-96.

[9] Durlinger A L，Gruijters M J，Kramer P，et al.Anti-mllerian horm one attenuates the effects of FSH on follicle development in the mouse ovary[J].Endocrinology，2001，142：4891-9.

[10] Pellatt L，Hanna L，Brincat M，et al.Granulosa cell production of anti-mllerian hormone is increased in polycyst ic ovaries[J].J Clin Endocrinol Metab，2007，92：240-5.

[11] Hasler J F.The current status and future of commercial embryo transfer in cattle[J].Anim.Reprod.Sci.2003,79，245-264.doi：10.1016/S0378-4320(03)00167-2.

[12] Mapletoft R J，Steward K B，Adams G P.Recent advances in the superovulation in cattle[J].Reprod.Nutr.Dev.2002,42，601-611.doi：10.1051/RND：2002046.

[13] Danielle Monniaux,Sarah Barbey，Charlene Rico，et al.Anti-Mü llerian hormone：a predictive marker of embryo production in cattlé [J].Reproduction，F(xiàn)ertility and Development，2010，22，1083-1091.

[14] Ireland J L，Mossa F，Lonergan P，et al.Does size matter in females? An overview of the impact of the high variation in the ovarian reserve on ovarian function and fertility，utility of anti-Müllerian hormone as a diagnostic marker for fertility and causes of variation in the ovarian reserve in cattle[J].Reprod.Fertil.Dev.2011,23，1-14.doi：10.1071/ RD10226.

[15] Monniaux D，diClemente N，Touzé J L，et al.Intrafollicular steroids and anti-mullerian hormone during normal and cystic ovarian follicular development in the cow[J].Biol.Reprod.2008,79，387-396.doi：10.1095/ BIOLREPROD.107.065847.

[16] Rico C，F(xiàn)abre S，Médigue C，et al.Anti-Müllerian hormone is an endocrine marker of ovarian gonadotropin-responsive follicles and can help to predict superovulatory responses in the cow[J].Biol.Reprod.2009,80，50-59.doi：10.1095/ BIOLREPROD.108.072157.

[17] 胡蓉，張曉梅，吳昕，等.抗苗勒氏管激素(AMH)預(yù)測卵巢儲備功能及反應(yīng)性的研究[J].生殖與避孕.2009,29(08):515-519，557.

[18] Visser J A，de Jong F H，Laven J S，et al.Anti-Mullerian hormone：a new marker for ovarian function[J].Reproduction,2006,131，1-9.doi：10.1530/REP.1.00529.

[19] Sezai Sahmay，Onur Guralp，Begum Aydogan，et al.Anti-Müllerian hormone and polycystic ovary syndrome：assessment of the clinical pregnancy rates in in vitro fertilization patients[J].Gynecological Endocrinology(Impact Factor：1.3).03/2013；DOI：10.3109/09513590.2013.769519.

[20] Ashraf Aleyasin，Marzie Aghahoseini，Sara Mokhtar，et al.Anti-mullerian hormone as a predictive factor in assisted reproductive technique of polycystic ovary syndrome patients[J].Acta medica Iranica 11/2011；49(11)：715-20.