王貞麗

醫(yī)藥技術的不斷進步推動了中醫(yī)藥理論的進一步發(fā)展。同時，也對中醫(yī)藥理論產(chǎn)生了很大的沖擊，暴露出許多問題。現(xiàn)代社會，人們對醫(yī)藥的使用提出越來越高的要求，含量確切、結構清楚、藥理明確等都是現(xiàn)代醫(yī)藥質量控制的主要特征［1］。而中藥中含有多種活性成分，單一的活性成分都無法體現(xiàn)中藥完整的療效。所以，中藥質量的控制及標準化是中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展過程中亟待解決的一個問題。中藥指紋圖譜是受到法醫(yī)學“指紋鑒定”的啟發(fā)形成的一種有效的鑒定中藥中所含成分相對關系的鑒定方法，自2000年08月國家藥品監(jiān)督管理局頒布 ［中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）］以來，中藥指紋圖譜技術受到很大重視，越來越多的醫(yī)藥學者致力于中藥指紋圖譜的研究。

所謂中藥指紋圖譜，是指不同種類或者產(chǎn)地的中藥材經(jīng)預處理后，通過一定的構建方法得到的能夠體現(xiàn)該種藥材成分特性，并可通過對比用于鑒別藥材真?zhèn)魏涂刂扑幉馁|量的色譜或光譜的圖譜。中藥指紋圖譜可以全面且直觀地反映中藥材或中藥制劑內(nèi)部活性成分的種類和數(shù)量，是目前公認用于鑒別藥材真?zhèn)魏涂刂扑幉馁|量最為有效的方法。本文總結了中藥指紋圖譜近幾年的研究和發(fā)展現(xiàn)狀，對常見的中藥指紋圖譜構建方法進行了綜述，并對指紋圖譜的發(fā)展和需要進一步研究問題提出了自己的一些看法。

1 中藥指紋圖譜的構建方法

中藥指紋圖譜的構建方法很多，主要有色譜法、光譜法、聯(lián)用技術、X射線衍射法、磁共振法等。其中，色譜法和光譜法是目前用于構建中藥指紋圖譜最常用的方法［2］。本文分別對這幾種方法進行了總結。

1．1 色譜法 目前用于構建中藥指紋圖譜的色譜法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、高效毛細管電泳法（HPCE）和高速逆流色譜指紋圖譜法（HSCCC）等。

1．1．1 薄層色譜法 （TLC） TLC是利用中藥成分性質上的差異經(jīng)過薄層分離后相對位移值的不同進行鑒別的一種方法［3］。該方法具有操作簡單，分析速度快，成本低等優(yōu)點，適用于不同種類藥材指紋圖譜的構建。使用該方法只需要選取好薄層色譜展開劑，分離樣品后即可獲得直觀的圖譜圖像。但是由于薄層板質量的差異和色譜系統(tǒng)的開放性等外界因素的影響，導致薄層色譜法的精確性和重現(xiàn)性比較差，所以現(xiàn)在薄層色譜法的應用較少。

蔣軼倫等［4］利用TLC法對不同等級，不同產(chǎn)地和不同采收期的丹參進行了指紋圖譜分析，實現(xiàn)了對不同等級丹參的歸屬，確立了丹參的最佳采收期。實驗證明了該方法的有效性，進而可用于丹參藥材的評價和質量控制。崔淑芬等［5］利用TLC對甘草藥材進行指紋圖譜的研究，為甘草藥材的質量控制提供了良好的理論依據(jù)。許重遠等［6］利用薄層色譜法對不同批次的復方蒲公英灌腸液的指紋圖譜進行比較，共發(fā)現(xiàn)6個含量差異較大的共有峰和2個非共有峰，為建立質量標準打下了良好的基礎。蘇星等［7］采用薄層色譜法對北沙參藥材的指紋圖譜進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的13批北沙參樣品均含有法卡林、二醇東莨菪素、傘形花內(nèi)酯、異歐前胡素等4個成分，但其含量有較大差別。

高效薄層色譜法是指利用特殊材質的薄層板和展開技術來提高薄層色譜的靈敏度和準確度，從而有效提高構建指紋圖譜的效率。丁陽平等［8］研究建立了茶黃素的高效薄層色譜（HPTLC）分離方法，研究表明流動相為甲醇，丙酮，冰乙酸按8∶5∶3體積比配制，預飽和時間為20 min時分離效果最佳。Rajkumar等［9］采用高效薄層色譜法對合歡苦味藥中的2種新的大環(huán)精胺生物堿藥物進行了指紋圖譜分析，揭示了合歡屬不同種的葉提取物中生物堿的含量差異很大，可用于不同物種的鑒別。

1．1．2 高效液相色譜法（HPLC） 高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜的基礎上發(fā)展而成的。HPLC利用了氣相色譜的理論和方法，其工作原理是依據(jù)中藥中各成分在展開劑和固定相之間分配系數(shù)的不同進行分離。HPLC受樣品本身和外界干擾的影響較小，非常適合用于中藥指紋圖譜的構建。HPLC具有儀器化程度高、分析速度快、色譜柱可反復使用等優(yōu)點，目前已成為指紋圖譜研究的主要方法，應用十分廣泛。該方法適用于成分相似的中藥材和成分相對復雜的中藥制劑的指紋圖譜的構建，但HPLC對儀器的依賴程度較高，且成本相對比較昂貴。

林新華等［10］利用HPLC對丁腈橡膠中2種防衰老劑的含量進行了測試。周欣等［11］利用高效液相色譜法，以19個主要共有峰為評價指標建立了銅仁地區(qū)丹參藥材的共有指紋圖譜。林海祿等［12］利用改進的HPLC法對夏枯草中熊果酸的含量進行了測試，結果表明了該方法的有效性。楊燕［13］通過高效液相法嘗試對護肝片中綠原酸的含量進行測試，結果表明該方法操作簡單，可行性高。李穎［14］利用高效液相色譜法建立了淫羊藿的指紋圖譜，并通過SAS統(tǒng)計軟件對不同產(chǎn)地和部位的淫羊藿的質量差異進行了聚類分析，取得了重要的研究結論。Yang等［15］通過HPLC指紋圖譜和多種有效成分定量分析結合的手段進行了雙黃連口服液的質量評價。通過HPLC指紋圖譜得到45個共有峰評測了來自不同生產(chǎn)商雙黃連口服液的成分組成的相似性，通過測定每種口服液中11種成分的含量評價了口服液質量。結果表明兩種方法結合穩(wěn)定可靠。王素雅等［16］針對HPLC法高效準確的優(yōu)點，對高效液相色譜法在乳品營養(yǎng)成分、食品添加劑、毒品和藥物殘留等方面的應用進行了綜述?；贖PLC法的各種優(yōu)點，目前該方法使用最為廣泛，許多學者對其進行了深入研究，并將該方法與其他方法聯(lián)用，組成更有效的聯(lián)用技術［17－20］。

1．1．3 氣相色譜法（GC） 氣相色譜法是一種封閉性的色譜技術，受到外界因素的干擾較小，穩(wěn)定性強。該方法以氣體作為流動相，具有高效性、檢測設備高選擇性和靈敏度高等優(yōu)點，常用于構建含有易揮發(fā)成分的中藥材的指紋圖譜。近年來，該方法常與MS聯(lián)用，構成GC－MS聯(lián)用技術，這樣不但可以知道不同中藥成分中所含揮發(fā)性成分的不同，還可以得到相同或相異成分的名稱。

Wang等［21］采用氣象指紋圖譜技術評價并且控制麻風樹種子油的質量。通過對貴州不同產(chǎn)地的10批樣品進行分析，有10個共有峰，其中7個被挑選出來用于與標準品對照進行定量分析。最終將10批樣品歸為3類，方法簡便可靠，未來可用于生物柴油的質量控制。翁德會等［22］對不同產(chǎn)地的姜厚樸飲片的氣相指紋圖譜進行了比較，最終確定恩施地區(qū)的姜厚樸飲片氣象圖譜為最佳指紋圖譜模式。王啟帥等［23］運用GC法對北柴胡中揮發(fā)性成分的指紋圖譜進行了相關研究，同時利用化學計量學進行分析，為柴胡藥材的定量研究打下了基礎。

1．1．4 高效毛細管電泳法（HPCE） 高效毛細電泳法的工作原理是利用高壓直流電場推動中藥樣品在毛細管中運動，由于樣品中各組分的淌度和分配行為的不同，導致不同組分在毛細管中產(chǎn)生運動上的差異，從而實現(xiàn)分離的一種技術。該方法利用了色譜和電泳2種分離技術，具有分離模式多、分離效率高、普適性強、節(jié)省樣品和試劑等優(yōu)點，特別適用于成分復雜的中藥材和帶電離子的分析，將其運用于中藥的指紋圖譜的研究，已取得可觀的成績。但利用電泳機制在毛細管中進行分離使得該方法的精確性和靈敏度較低，所以目前的使用并不是很廣泛。孫國祥等［24，25］分別建立了柏子養(yǎng)心丸（BZYXW）和補中益氣丸（BZYQW）的指紋圖譜，為BZYXW和BZYQW的質量控制提供了有效參考。

1．1．5 高速逆流色譜法 （HSCCC） HSCCC法是一種液－液分配技術。該方法利用互不相容的2種溶劑作為流動相，在移動的過程中將樣品中不同分配比的成分分離。該方法具有操作簡單、適用范圍廣、對樣品的預處理要求低且可重復進樣的優(yōu)點。顧銘等［26］通過利用該方法對不同批次的丹參脂溶性成分的研究，證明了高速逆流色譜法用作中藥指紋圖譜研究的可靠性和有效性。沈平孃［27］利用該方法對多種中藥進行了指紋圖譜的研究，均取得了良好效果。

1．2 光譜法 光譜法主要包括紅外光譜 （IR）、紫外光譜（UV）和熒光光譜（AFS）等3種方法。其中IR和UV是目前常用的2種用于中藥指紋圖譜建立的方法。這2種方法對于成分簡單的單味藥材具有良好的鑒別效果，但由于其加和性，對于較為復雜的中藥制劑難以準確判斷。

1．2．1 紅外光譜法（IR） 紅外光譜是由于分子振動、躍遷產(chǎn)生的，反映化合物分子的整體結構，能用于整個化合物分子的鑒定。當藥材中化合物分子穩(wěn)定時，利用該方法建立指紋圖譜可用于藥材的鑒定。純化合物的IR具有特征峰，中藥材的IR是中藥中各種成分IR的疊加，隨著化合物種類的增加，混合物的特征逐漸減小。所以紅外光譜對于具有多種混合物的中藥鑒別效果較差。徐海星等［28］利用紅外光譜法對藥材白英的不同部位建立了指紋圖譜，經(jīng)實驗分析最終建立了白英藥材的FTIR的鑒定新方法。也有文獻介紹了利用紅外光譜法對不同產(chǎn)地的花椒的指紋圖譜進行了研究［29］，為以后的研究提供了很有意義的理論參考。對延胡索和全夜延胡索的鑒別也采用了這種方法［30］。

1．2．2 紫外光譜法（UV） 紫外光譜是電子光譜，反映的是分子的電子結構特征，一般只有一個或幾個形狀變化不大的寬大吸收帶。該方法具有操作簡單，快速性、重現(xiàn)性好的優(yōu)點，常用于對成分簡單的中藥材指紋圖譜的建立。但是，不同化合物有時會具有相似的吸收光譜，造成了多種成分之間的相互干擾，降低了該方法的可鑒別性，因此常用分光法或模糊數(shù)學法使其達到理想效果。Jun等［31］通過建立紫外光譜指紋圖譜評價了3種常用中藥的退熱功效，結果與藥理學實驗相一致，證明了方法可靠且可行。文獻利用紫外光譜法對指紋圖譜的相似度進行比較實現(xiàn)了對苦蕎粉的真假鑒定［32］。

1．2．3 熒光光譜法（AFS） AFS的基本原理是蒸汽狀態(tài)的原子因吸收能量而躍遷至高能態(tài)，并在這個過程中發(fā)射出具有固定波長的熒光。該方法的優(yōu)點是靈敏度高，可同時對多個成分進行檢測且應用范圍廣泛。王立屏［33］利用AFS對中藥牛蒡子的三維熒光指紋圖譜進行了研究，最終提出了一種對牛蒡子進行質量控制和鑒別的有效方法。其他文獻也對三維熒光光譜法在中藥材質量控制中的應用進行了許多有意義的研究［34，35］。

1．3 聯(lián)用技術 色譜法具有良好的分離能力，波普法具有較好的結構鑒別能力。建立中藥指紋圖譜的方法有很多，這些方法各有其優(yōu)缺點和適用條件。目前，許多專家已經(jīng)嘗試將不同方法聯(lián)合使用共同建立中藥的指紋圖譜，取得了很大的進展。Li等［36］研究了2007年—2011年的350篇關于HPLCMS聯(lián)用技術在中藥分析中的應用的學術論文，重點總結了其在成分分析、代謝產(chǎn)物分析和藥物動力學方面的應用。其中50%的文獻是與中藥成分分析相關，這說明了HPLC－MS技術在現(xiàn)代中藥色譜分析中作為最有效的分析手段正在得到更廣泛的應用。喬懷耀等［37］利用超高效液相色譜－質譜聯(lián)用技術建立了舒肝解郁膠囊的指紋圖譜，結果表明該方法可用于舒肝解郁膠囊的質量控制。也有文獻利用氣相色譜－質譜（GC－MS）聯(lián)用技術分別對青稞酒和魚腥草的有效成分進行了研究，取得了很好的效果［38，39］。

1．4 其他技術 隨著醫(yī)藥技術的不斷發(fā)展和跨學科知識的應用，涌現(xiàn)出許多構建中藥指紋圖譜的新方法。例如：X射線衍射法、磁共振法和分子生物技術等。

X射線衍射法構建指紋圖譜的原理是利用不同物質由于分子結構不同，受到X射線照射時會產(chǎn)生不同衍射現(xiàn)象的特點來構造特有的衍射圖譜。該方法具有快速簡單，節(jié)省樣品等優(yōu)點，目前主要分為單晶衍射法和粉末衍射法。也有文獻利用X射線衍射法分別對不同中藥的指紋圖譜進行了研究，取得了可觀的成果［40－43］。對于植物類藥材，它們所含的特殊活性成分都有其固定的指紋圖譜，不同種類之間難以混淆。而磁共振（NMR）是利用不同中藥樣品中特征成分元素的原子來構建磁共振譜，因此非常適用于植物類藥材的指紋圖譜的構建［44］。也有文獻通過對銀杏黃銅的磁共振指紋圖譜的研究找到了一種有效的質量控制方法［45］。對不同生物體都有其唯一的DNA分子序列，利用遺傳技術可以構建不同中藥的DNA指紋圖譜，該方法雖然對技術要求較高，但表現(xiàn)出廣闊的應用前景。此外，狄恒建等［46］采用RP－HPLC法對炒牛蒡子配方顆粒的HPLC指紋圖譜進行了研究，并對其建立了共有模式。除了以上分析的這些方法外，還有許多效果明顯的方法也被大量應用。

2 中藥指紋圖譜構建研究中的值得關注的問題

目前國內(nèi)外許多專家和學者對中藥指紋圖譜進行了許多卓有成效的研究，應用各種方法構建了許多中藥藥材和制劑的中藥指紋圖譜。但關于中藥指紋圖譜的研究仍有許多值得關注的地方。

2．1 根據(jù)構建指紋圖譜的各種方法的優(yōu)缺點和適用方向，以及不同種類中藥組分的特點，合理選擇構建方法來獲得最佳的指紋圖譜，從而實現(xiàn)對中藥質量的控制 指紋圖譜的構建方法本身并無優(yōu)劣之分，只是不同的方法在處理不同組分的中藥時可以得到不同的效果。目前圖譜解析尚無一種普遍適用的方法，可視具體情況靈活選擇一種合適的化學模式識別方法［47，48］。所以，如何綜合考慮各方面的因素來選擇一個最為科學合理的構建方法是值得深入研究的一個問題。

2．2 多種構建指紋圖譜的方法相互結合使用已經(jīng)成為一種趨勢 由于中藥制劑的組分十分復雜，而且各組分之間的活性各不相同，單一的指紋圖譜構建方法不能很好的實現(xiàn)對中藥指紋圖譜的構建。更多的學者開始使用聯(lián)用技術進行復雜中藥圖譜的建立，并且取得了良好的效果。聯(lián)用技術兼有多種構建方法的優(yōu)點，可以更好的完成復雜中藥制劑的指紋圖譜的建立。因此，構建方法的合理聯(lián)用實現(xiàn)互補已經(jīng)成為中藥指紋圖譜的研究趨勢。例如：HPLC－MS、HPLC－NMR、GCMS等。

2．3 拓寬構建思路，多學科知識的交互應用可以更好的實現(xiàn)中藥指紋圖譜的建立 中藥學科是一個十分復雜，涉及領域寬廣的學科，所以對中醫(yī)藥的深入研究需要運用多個學科的知識。例如：物理電泳原理、模糊數(shù)學、化學計量學等。這些學科的應用可以使建立的指紋圖譜達到更理想的效果。Yan等［49］將數(shù)據(jù)可視化技術與光譜技術結合建立了干紅葡萄酒的指紋圖譜，用于我國干紅葡萄酒的鑒別和質量控制。

綜上所述，可見我國中藥質量控制由單一成分的檢測逐漸發(fā)展到現(xiàn)在對多種活性成分的檢測和鑒別，漸漸形成中藥質量控制標準的雛形。在這個過程中，中藥指紋圖譜技術起到了不可替代的作用。作為一種能夠整體反映中藥內(nèi)部各成分含量的新技術，中藥指紋圖譜技術是目前公認的最有效的中藥質量控制技術。目前我國對中藥指紋圖譜技術的研究還處于不成熟階段，許多中藥指紋圖譜技術研究中仍有需要解決的問題。例如：如何解決化學成分和藥效的相關性等問題［50］。本文對常見的構建中藥指紋圖譜技術的方法進行了綜述，指出了其各自的優(yōu)缺點及適用情況，并提出了一些自己的看法，具有一定的借鑒意義，但研究尚有許多不足之處，需要進一步完善。

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