桑 桑 呂方啟

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒外科，山東 泰安 271000)

自從法國(guó)Bordeaux兒童醫(yī)院的醫(yī)師Léauté-Labrèze等于2008年在《新英格蘭醫(yī)學(xué)》上首次介紹普萘洛爾(propranolol，心得安)用于血管瘤的治療后[1]，開(kāi)創(chuàng)了普萘洛爾治療血管瘤的先河。因血管瘤的內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞有同樣的生成機(jī)制，本文就普萘洛爾治療血管瘤的機(jī)制推斷出普萘洛爾治療腫瘤的可行性。

背景：血管瘤的主要發(fā)生機(jī)制為促進(jìn)血管形成因子及抑制血管形成因子的水平失衡。促進(jìn)血管形成的因子中最主要的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，機(jī)制為促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活躍。另外，VEGF與bFGF在血管瘤消退期的表達(dá)顯著減少。然而，腫瘤的形成主要是腫瘤血管的異常增生，腫瘤的血管生成處于持續(xù)、失控的生長(zhǎng)狀態(tài)，管腔不規(guī)則，基底膜薄且無(wú)周?chē)?xì)胞或者平滑肌細(xì)胞包繞，不接受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的精細(xì)調(diào)節(jié)?，F(xiàn)已證實(shí)，各種實(shí)體腫瘤血管生成過(guò)程中涉及諸多影響血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的內(nèi)、外源性細(xì)胞因子及受體，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體(VEGFR)在腫瘤的血管形成和內(nèi)皮細(xì)胞存活過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。普萘洛爾作用機(jī)制：(1)抑制一氧化氮(NO)合成與釋放，從而導(dǎo)致瘤體血管收縮，此在臨床表現(xiàn)為用藥后短時(shí)間內(nèi)瘤體顏色變淺，觸診質(zhì)地變軟。(2)下調(diào)VEGF與bFGF的表達(dá)而抑制血管生成，并表現(xiàn)為用藥中期血管瘤的生長(zhǎng)阻滯。(3)介導(dǎo)并加速毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致用藥后期瘤體消退。另外，普萘洛爾抑制間質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)以及人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HB-MEC)的表達(dá)也可能潛在地抑制了血管瘤的血管生成。由此可以推定普萘洛爾可以作為遏制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的靶向藥物。

假設(shè)理論/想法：2008年，法國(guó)Bordeaux兒童醫(yī)院的Léauté-Labrèze等[1]發(fā)現(xiàn)，在使用普萘洛爾治療1例伴肥厚梗阻性心肌病和1例心輸出量增加患兒合并面部血管瘤時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)應(yīng)用普萘洛爾后血管瘤體表面顏色變淺(深紅變?yōu)?紅)，質(zhì)地變軟，范圍縮小。在征得患兒父母同意后，另外9例頜面部血管瘤患兒使用了普萘洛爾，用藥后24h患者血管瘤顏色均變淺，質(zhì)地變軟，腫瘤體積不同程度縮小。除個(gè)別病例出現(xiàn)血壓偏低外，未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。自此以后，國(guó)內(nèi)外有大量關(guān)于普萘洛爾治療血管瘤的報(bào)告，2年間普萘洛爾治療血管瘤從偶然發(fā)現(xiàn)到迅速成為部分血管瘤治療的一線(xiàn)藥物。

1 普萘洛爾治療血管瘤的作用機(jī)制

普萘洛爾治療IH的機(jī)制迄今尚未完全明確。目前，比較公認(rèn)的[1-4]治療機(jī)制認(rèn)為可能是以下3個(gè)方面共同作用的結(jié)果：(1)抑制一氧化氮(NO)合成與釋放，從而導(dǎo)致瘤體血管收縮，此在臨床上表現(xiàn)為用藥后短時(shí)間內(nèi)瘤體顏色變淺，觸診質(zhì)地變軟。(2)下調(diào)VEGF與bFGF的表達(dá)而抑制血管生成，并表現(xiàn)為用藥中期IH的生長(zhǎng)阻滯(growth retardation)。(3)介導(dǎo)并加速毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致用藥后期瘤體消退。

1.1臨床驗(yàn)證

實(shí)踐證實(shí)普萘洛爾治療血管瘤起效快，療效確切，個(gè)體差異小，不良反應(yīng)少。其治療機(jī)制可能為多因素作用的結(jié)果，對(duì)血管瘤早期、中期和長(zhǎng)期的作用可能有3個(gè)不同機(jī)制:在應(yīng)用早期，通過(guò)降低NO釋放，使血管收縮；中期療效機(jī)制可能與阻斷血管形成的相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)；長(zhǎng)期療效機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤消退[5]。

1.2對(duì)局部血管的收縮作用

在治療前期，如用藥24h后瘤體顏色變淺，觸診質(zhì)地變軟，可能系血管收縮的原因。通過(guò)降低NO釋放收縮周?chē)?，減小瘤體體積，該過(guò)程較為迅速[6]。

1.3抑制血管生成因子(VEGF和bFGF)表達(dá)

血管瘤的形成是血管生成無(wú)節(jié)制或血管生成因子和抑制因子作用不平衡造成的。VEGF和bFGF在血管瘤形成中具有重要作用[7]。VEGF是一種糖基化分泌性多肽因子，亦稱(chēng)血管滲透因子，可使內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，提高血管通透性，促進(jìn)新生血管和基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。bFGF是一種強(qiáng)烈的內(nèi)皮細(xì)胞和管壁結(jié)締組織促生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)，形成毛細(xì)血管樣組織，誘導(dǎo)VEGF分泌。血管瘤標(biāo)本中VEGF mRNA和bFGF mRNA在增殖期的表達(dá)水平高于消退期[8]。通過(guò)比較增殖期血管瘤患者、血管畸形和正常嬰幼兒尿中bFGF時(shí)發(fā)現(xiàn)增殖期血管瘤患者尿中bFGF增高，而血管畸形和正常嬰幼兒尿中bFGF正常[9]。在小鼠胎盤(pán)激活β腎上腺受體可刺激VEGF形成，普萘洛爾可通過(guò)下調(diào)VEGF降低新生小鼠低氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變[10]。

1.4加速血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是引起血管瘤自行消退的重要原因之一，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在增殖期很低，而消退期細(xì)胞凋亡數(shù)目可達(dá)增殖期的5倍多，從而促進(jìn)瘤體消退[11,12]。

1.5抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生成及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的分泌

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是抑制血管瘤生長(zhǎng)的天然屏障，其降解是血管生成中必不可少的環(huán)節(jié)。ECM降解接受MMP及其活性抑制劑--金屬蛋白酶組織抑制劑的共同調(diào)節(jié)。MMP家族能降解細(xì)胞外基質(zhì)，引起血管瘤的增殖，其中MMP-9在增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)明顯高于消退期及正常組織，在血管瘤生成尤其在降解基底膜過(guò)程中發(fā)揮巨大作用[13]，通過(guò)抑制MMP-9分泌可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和新生血管形成，減少人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成[14]。在體外培養(yǎng)的高表達(dá)β2-腎上腺素受體的人大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中加入普萘洛爾后，體外培養(yǎng)的血管生成大幅度減少，顯著降低MMP-9分泌，提示普萘洛爾可以抑制人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生成和MMP-9分泌，從而抑制血管瘤生長(zhǎng)[15]。

1.6作用G-蛋白信號(hào)等通路

β-腎上腺素受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，研究發(fā)現(xiàn)腎上腺素及普奈洛爾對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力有影響，在氧化應(yīng)激時(shí)，腎上腺素通過(guò)作用于β2受體合成谷胱甘肽，選擇性保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力。普奈洛爾對(duì)嬰幼兒血管瘤的作用可能就是阻滯了這一保護(hù)作用[16]。普萘洛爾抑制血管生成不僅包括對(duì)β-腎上腺素受體信號(hào)的抑制，也抑制了VEGFR-2通路。研究表明，普萘洛爾通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期依賴(lài)激酶(CDK)和CDK的細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑，引起內(nèi)皮細(xì)胞停滯在G1細(xì)胞周期，抑制VEGF受體-2(VEGFR-2)信號(hào)通路，抑制MMP-2分泌[17]。

2 腫瘤的發(fā)生機(jī)制

血管生成在人類(lèi)惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。腫瘤血管生成是所有實(shí)體腫瘤的共同特征，是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移必須依賴(lài)的病理學(xué)基礎(chǔ)?，F(xiàn)已證實(shí)，不同實(shí)體腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的生長(zhǎng)因子及其受體均有共性，腫瘤的血管生成處于持續(xù)、失控的生長(zhǎng)狀態(tài)，管腔不規(guī)則，基底膜薄且無(wú)基質(zhì)細(xì)胞或者平滑肌細(xì)胞包繞，不接受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的精細(xì)調(diào)節(jié)?，F(xiàn)已證實(shí)，各種實(shí)體腫瘤血管生成過(guò)程中涉及諸多影響血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的內(nèi)、外源性細(xì)胞因子及受體，其中VEGF及其受體(VEGFR)在腫瘤的血管形成和內(nèi)皮細(xì)胞存活過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)>2 mm時(shí)，因缺氧刺激VEGF表達(dá)上調(diào)，與內(nèi)皮細(xì)胞上的酪氨酸激酶型受體--VEGFR結(jié)合自身發(fā)生磷酸化，激活內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種蛋白酶以降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，使內(nèi)皮細(xì)胞游離并向VEGF等刺激因子聚集部位遷移。與此同時(shí)，通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，形成條索狀血管雛形。通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞外基質(zhì)，并經(jīng)血管重塑，形成腫瘤新生血管。因此抑制腫瘤血管增殖、阻斷上述生長(zhǎng)因子與其受體的結(jié)合成為抑制腫瘤血管生成的重要舉措。通過(guò)普萘洛爾治療血管瘤的機(jī)制可推斷出普萘洛爾也可以抑制腫瘤的血管異常增生，并且能夠成為治療腫瘤的靶向藥物。

假說(shuō)驗(yàn)證：如果普萘洛爾可以治療異常的血管瘤增生，推定其可以作為治療腫瘤的藥物，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證。

2.1神經(jīng)母細(xì)胞瘤大鼠模型制備

(1)材料：選用SPF(specific-pathogen free)級(jí)BALB/C-NU裸鼠。鼠齡：4周。體重：18～22 g。先在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1～2 d，溫度25 ℃±2 ℃、濕度75%RH，籠盒每周高壓滅菌一次(121 ℃，1.034×105 Pa，滅菌20 min)。飲用水經(jīng)高壓滅菌(121 ℃，1.034×105 Pa，滅菌20 min)，標(biāo)準(zhǔn)飼料經(jīng)Co-60照射滅菌，供裸鼠自由攝食，每周添加2次飲用水和飼料。墊料為碎玉米芯經(jīng)高壓滅菌(121 ℃，1.034×105 Pa，滅菌20 min)，每周更換2次墊料。(2)個(gè)性化人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織塊種植方法：從手術(shù)切除的人瘤體新鮮標(biāo)本中切取 直徑約1 cm左右組織塊，保存于加入青一鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在標(biāo)本獲取6h之內(nèi)進(jìn)行種植。超凈T作臺(tái)內(nèi)以RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織塊，用剪刀將組織塊修剪成直徑約2mm的小塊，用25號(hào)接種針將其種植于BALBC裸鼠背部皮下組織內(nèi)，每例人新鮮標(biāo)本均移植入5只裸鼠體內(nèi)，整個(gè)腫瘤組織塊的制備和種植在無(wú)菌條件下進(jìn)行，成瘤者為荷瘤模型。

2.2普萘洛爾效果觀察

荷瘤模型分為3組。在無(wú)特定病原體(SPF)條件下飼養(yǎng)，種植同一例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者標(biāo)本組織塊的5只裸鼠飼養(yǎng)于同一籠舍之內(nèi)。每日觀察接種部位腫瘤生長(zhǎng)情況，待發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)后，A組給與生理鹽水、B組給與環(huán)磷酰胺、C給與普萘洛爾腹腔注射，每隔一天測(cè)1次腫瘤直徑，計(jì)算腫瘤體積V，V=(D×d)/2，D為腫瘤表面最長(zhǎng)徑，d為腫瘤表面最短徑。2周后處死，①取血清檢測(cè)尿香草扁桃酸(VMA)、鐵蛋白(SF)、乳酸脫氫酶(LDH)、神經(jīng)元特異性稀醇化酶(NSE)等生化指標(biāo)測(cè)定。②腫瘤血管密度(microvessel density，MVD)的檢測(cè)：采用鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶連接法(S-P法)檢測(cè)。將裸鼠移植瘤剝離，HE染色切片。在低倍電鏡下掃視整個(gè)切片，找到瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞染色清晰、高血管密度區(qū)(熱點(diǎn))，再用中倍鏡在熱點(diǎn)中計(jì)數(shù)CD34抗體染色的陽(yáng)性血管數(shù)，取3個(gè)熱點(diǎn)的平均陽(yáng)性血管數(shù)。③電鏡觀察：觀察3組腫瘤細(xì)胞的線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、基質(zhì)電子密度的變化。分析3組差異，推定普洛萘爾的治療效果。

預(yù)測(cè)結(jié)果：沒(méi)有做治療的一組，腫瘤會(huì)繼續(xù)增大，做傳統(tǒng)化療的一組可出現(xiàn)腫瘤減小，兒而毒副反應(yīng)較多。用普萘洛爾治療一組也會(huì)出現(xiàn)腫瘤減小，而副反應(yīng)較少。最終確定普萘洛爾能否作為腫瘤治療的靶向藥物。進(jìn)一步應(yīng)用于臨床病人的治療。

經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)：普萘洛爾是非選擇性腎上腺B受體阻滯藥，能競(jìng)爭(zhēng)性拮抗神經(jīng)遞質(zhì)(neurotransmitter)和兒茶酚胺(catecholamine)對(duì)B-受體的激動(dòng)作用。臨床上通常用于治療高血壓、室上性心動(dòng)過(guò)速、缺血性心臟病、心律失常等。在嬰幼兒和兒童一般用來(lái)治療心臟疾病或新生兒甲狀腺功能亢進(jìn)癥[18]，尚未發(fā)現(xiàn)由腎上腺素受體阻滯藥直接引起的死亡或嚴(yán)重心臟問(wèn)題。40多年臨床實(shí)踐證實(shí)普萘洛爾安全、耐受性好。已有關(guān)于應(yīng)用普萘洛爾成功治療顏面部[19]、眼部[20-23]、呼吸道[24-28]、肝臟[29，30]以及其他伴有并發(fā)癥、多病變部位、甚至嚴(yán)重威脅患兒生命的重癥IH[31-33]的大量報(bào)道，并證實(shí)了普萘洛爾能改變IH的自然病史、阻滯其增殖、介導(dǎo)并促進(jìn)IH的早期凋亡。進(jìn)一步的研究表明，普萘洛爾對(duì)處于增殖期與消退期的IH均有顯著療效[34，24]。另外，單獨(dú)使用普萘洛爾(而不借助其他任何藥物治療或手術(shù)治療等手段)治療IH也已經(jīng)被證實(shí)有確切療效[35，36]，從而消除了對(duì)IH的治療效果是由其他治療手段所主導(dǎo)的疑慮。諸多學(xué)者推薦其取代皮質(zhì)類(lèi)固醇激素,成為IH的一線(xiàn)治療手段[24，37-39]。中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)口腔頜面外科專(zhuān)業(yè)委員會(huì)脈管性疾病學(xué)組也已確定普萘洛爾為治療血管瘤的一線(xiàn)藥物，并納入《口腔頜面部血管瘤治療指南》[39]。

假設(shè)結(jié)果：當(dāng)前治療腫瘤仍然是我們醫(yī)學(xué)工作者的重點(diǎn)工作。腫瘤治療傳統(tǒng)的化療藥物，毒副反應(yīng)較多。靶向藥物價(jià)格昂貴，使很多貧窮地區(qū)的患者無(wú)奈的放棄治療，令人痛心。普萘洛爾如果能夠作為治療腫瘤的靶向藥物，就可以解決毒副反應(yīng)多、藥費(fèi)昂貴弊端。對(duì)于貧窮、欠發(fā)達(dá)國(guó)家的患者堪稱(chēng)福音。

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