陸俊國，李 桃，丁令池，陳 希，劉繼斌

(江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，江蘇 南通，226001)

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，目前發(fā)病率在中國逐年升高，非小細胞肺癌(NSCLC)在肺癌中占70%～80%。流行病學及病因?qū)W研究[1]證實，肺癌發(fā)生是遺傳易感和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。單核苷酸多態(tài)(SNP)是最常見的遺傳多態(tài)，它組成了個體不同的遺傳背景。本研究探討NSCLC中ERCC2/XPD Lys751Gln，RAD51 codon 135以及 BAG-1codon 324 SNP的表達與臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008—2011年本院收治非小細胞肺癌患者100例，男59例，女41例，年齡31～76歲，平均59歲。另選取正常人80例作為對照組。南通市腫瘤醫(yī)院住院的初治晚期NSCLC患者均經(jīng)病理學確診，無年齡、性別差異。病例組平均年齡(57.15±10.23)歲，對照組平均年齡(54.46±10.15)歲。病例組和對照組的年齡、性別、吸煙、飲酒情況比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究對象均簽署書面知情同意書，完成流行病學調(diào)查并自愿提供一份5 mL的外周血樣，所有標本取材以及研究方案均獲得本院倫理委員會的批準。

1.2 DNA提取和基因多態(tài)性的檢測

在告知患者的前提下，所有受試者空腹抽取靜脈血5 mL，置-20 ℃冷凍備用?；蚪MDNA的提取采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法，以聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對RAD51 codon 135、ERCC2/XPDLys751Gln和BAG-1 codon 324多態(tài)性進行檢測。ERCC2/XPD基因的引物為5′-CTTCATAAGACCTTCTAGCACCAC-3′和5′-TACGGACATCTCCAAATTCATTC-3; BAG-1codon 324的引物為，5′-CAGGTAGTGTAGGAGCGTGGTG-3′和5′-CACCCAGAGGTCCAAACAGC-3′; RAD51 codon 135引物為5′-CACCTAACTGGCATCTTCACTT-3′和5′-ACAGGATAAGGAGCAGGGTT-3′。PCR反應體系: 20 μL中含50 ng基因組DNA，12.5 pmol/μL各引物，0.1 mmol/L各單核苷酸，1.8 mmol/L MgCl2，1.0 U Taq酶，1×PCR反應緩沖液。PCR反應條件：預變性5 min; 95 ℃ 30 s、退火45 s、72 ℃ 60 s，共40個循環(huán); 72 ℃，延伸6 min。PCR產(chǎn)物均用內(nèi)切酶PstⅠ 37 ℃溫育，在3.0%瓊脂糖凝膠80 v電泳上100 min檢測電泳、溴化乙啶染色分析酶切產(chǎn)物以此確定各基因型。本研究由2人使用盲法對基因型分別進行判讀，對判讀不一致的樣本進行基因型的重新檢測。隨機抽取10%樣本，使用雙盲法重復檢測驗證，結(jié)果一致。

1.3 統(tǒng)計學檢測

采用SAS 9.1.3統(tǒng)計軟件，分別統(tǒng)計3種基因型的分布頻率，同時使用χ2檢驗確認其是否符合Hardy-Weinberg平衡。本研究使用的統(tǒng)計方法包括χ2檢驗，計量資料的t檢驗和方差分析，比值比(OR)計算風險比例及其95%可信區(qū)間(CI); 同時使用Logistic回歸分析分析各基因型與環(huán)境危險因素之間的交互作用。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC患者BAG-1 codon 324、RAD51codon 135、ERCC2/XPD Lys751Gln基因型分布

BAG-1 codon 324、RAD51 codon 135、ERCC2/XPD Lys751Gln基因型頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡(P=0.41，P=0.56，P=0.51)。100例NSCLC 患者中，經(jīng)測序以及PCR-RELP分析結(jié)果顯示，BAG-1 codon 324存在3 種等位基因型?；蛐偷姆植碱l率分別為C/C型占81%(81/100)、C/T型占19%(19/100)以及T/T型占0%(0例); ERCC2/XPD 751基因型的分布頻率分別為C/C 型69例(69%)、C/A基因26例(30%)和A/A基因型5例(5%); RAD51 codon 135基因型的分布頻率分別G/G型占67%(67/100)、G/C型33%(33/100)、未現(xiàn)C/C型。與野生基因型C/C型相比,攜帶ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型者患NSCLC的OR分別是1.42(95% CI: 1.11～2.64)和1.25( 95% CI: 0.33～4.35)，經(jīng)年齡、吸煙、飲酒、飲茶和家族史等調(diào)整后OR分別是1.53(95% CI: 1.15～3.32)和0.58(95% CI: 0.15～2.39)。

與野生基因型C/C型相比，攜帶BAG-1C/T基因型者患NSCLC的OR是1.37(95% CI: 1.22～2.84)，經(jīng)年齡、吸煙、飲酒、飲茶和家族史等調(diào)整后OR是1.28(95% CI: 1.08～2.74); 與野生基因型G/G型相比，RAD51 G/C基因型者患NSCLC的OR分別是1.33(95% CI: 1.19～2.92)，經(jīng)年齡、吸煙、飲酒、飲茶和家族史等調(diào)整后OR是1.03(95% CI: 1.06～2.29)。

2.2 RAD51、ERCC2和BAG-1基因多態(tài)性和NSCLC臨床病理特征的關(guān)聯(lián)分析

經(jīng)年齡、吸煙、飲酒和家族史等調(diào)整后，ERCC2/XPD C/C基因型多態(tài)性與腫瘤大小、包膜有無、腫瘤多發(fā)、分化程度、Edmondson-Steiner分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、遠處轉(zhuǎn)移的幾率均無顯著相關(guān)性(P>0.05); ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型多態(tài)性與腫瘤大小、包膜有無、腫瘤多發(fā)、分化程度、Edmondson-Steiner分期、TNM分期亦無顯著相關(guān)性(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有顯著相關(guān)性(P=0.038，OR=2.26，95% CI: 1.69～3.59); 與遠處轉(zhuǎn)移幾率的相關(guān)性更顯著(P=0.005，OR=2.47，95%CI: 1.38～4.24)。

BAG-1 codon 324 C/T型，RAD51 codon 135 G/C型基因多態(tài)性與腫瘤大小、包膜有無、腫瘤多發(fā)、分化程度、Edmondson-Steiner分期、TNM分期亦均無顯著相關(guān)性(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有顯著相關(guān)性(P=0.042，OR=2.57，95% CI: 1.62～4.44;P=0.049，OR=2.86，95% CI: 1.39～3.62)。

3 討 論

中國肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年升高，位居城市人口中惡性腫瘤之首[2]，非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%,并且初治時約70%是晚期患者。目前導致肺癌發(fā)生的確切病因還沒有找到，但環(huán)境污染是導致肺癌的重要致病因素之一，其中吸煙是最重要的危險因素[3]。有研究[4-5]發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)暴露于相同致病環(huán)境中，只有少部分人患病，由此得出基因多態(tài)性等遺傳因素在肺癌發(fā)生的過程中起到重要作用。

ERCC2又稱著色性干皮病基因D (XPD)，ERCC2/XPD的作用是通過核苷酸切除修復(NER)途徑去除各種因素導致的DNA損傷[6]。目前對XPD 的檢測缺乏大樣本，結(jié)果也爭議較大。袁凡等[7]對中國151例晚期NSCLC 患者進行的研究結(jié)果表明，XPD Lys751Gln基因多態(tài)性與肺癌的發(fā)生發(fā)展沒有相關(guān)性，與患者的病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床腫瘤分期等臨床病理特征都無相關(guān)性。Liang等[8]研究表明，ERCC2/XPD 751Lys/Gln多態(tài)性是中國肺癌發(fā)生的危險因素之一，攜帶變異型等位基因751Gln的患者發(fā)生肺癌的風險是751Lys/Lys純合子的2倍，這與本研究結(jié)果一致。BAG-1作為一種抗凋亡基因，通過與多種靶蛋白結(jié)合從而抑制細胞凋亡，有研究[9]表明BAG-1可能在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過程中起作用。RAD51蛋白作為同源重組(HR)過程中的關(guān)鍵酶，使核酸蛋白在單鏈或雙鏈DNA 復制期間完成同源配對和鏈交換反應[10]。在已經(jīng)有的BAG-1 codon 324，RAD51 codon 135多態(tài)性和 NSCLC的關(guān)系探討中，彭亞婷等[11]認為與攜帶RAD51變異基因型(G/C和C/C)的個體具有更高的患癌風險(P<0.05)，但與肺癌的病理學類型及組織學分級無相關(guān)性;陶雪勤等[12]研究發(fā)現(xiàn)與攜帶G/G的個體相比，攜帶Rad51G135C變異基因型(G/C和C/C)的個體具有更高的患癌風險(P<0.05)。

本次研究發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPD與RAD51 codon 135 以及BAG-1 codon 324基因多態(tài)性與NSCLC發(fā)生關(guān)系密切，與野生基因型C/C型相比,攜帶ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型者患NSCLC的OR分別是1.53(95% CI: 1.15～3.32) 和0.58(95% CI: 0.15～2.39); 與野生基因型C/C型相比，攜帶BAG-1C/T基因型者患NSCLC的OR是 1.28(95% CI: 1.08～2.74); 與野生基因型G/G型相比，RAD51 G/C基因型者患NSCLC的OR是1.03(95% CI: 1.06～2.29)，盡管ERCC2/XPD 與RAD51 codon 135以及BAG-1 codon 324基因多態(tài)型在NSCLC發(fā)生中的作用仍存爭議，但本次研究發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPD 與RAD51 codon 135以及BAG-1 codon 324基因多態(tài)性改變增加了NSCLC發(fā)生的風險，并在研究中發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型多態(tài)性與BAG-1 codon 324 C/T型，RAD51 codon 135 G/C 型多態(tài)性與腫瘤大小、包膜有無、腫瘤多發(fā)、分化程度、Edmondson-Steiner分期、TNM分期等因素均無相關(guān)性(P>0.05)，但ERCC2/XPD C/A和A/A基因型多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有相關(guān)性(P=0.038，OR=2.26，95% CI: 1.69～3.59); 與遠處轉(zhuǎn)移幾率的相關(guān)性更顯著(P=0.005，OR=2.47，95%CI: 1.38～4.24)。BAG-1 codon 324 C/T型，RAD51 codon 135 G/C型基因多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有相關(guān)性(P=0.042，OR=2.57，95% CI: 1.62～4.44;P=0.049，OR=2.86，95% CI: 1.39～3.62)。

大量的研究認為與野生基因型C/C型相比，攜帶ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型,可明顯減少染色單體型畸變的修復能力[13]，這種染色體的損傷在合并吸煙的人群中更為常見[14]，說明正是攜帶變異型等位基因C/A基因型和A/A基因型的NSCLC患者降低了染色單體型變異的修復能力，從而使得增加了腫瘤的侵襲性以及遠處轉(zhuǎn)移的能力，并且這部分人中群中大多數(shù)患者合并吸煙。因而對于攜帶ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型的NSCLC患者應該規(guī)勸戒煙，一方面提示作者在高危人群中應盡早提前干預，另一方面也提示作者ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型多態(tài)性與BAG-1 codon 324 C/T型，RAD51 codon 135 G/C 型基因基因型可以預測NSCLC的侵襲性或轉(zhuǎn)移行為。

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