董春霞 何 琴

(1.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120；2.重慶市巴南區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401320)

口蹄疫的實驗室診斷

董春霞1何 琴2

(1.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120；2.重慶市巴南區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401320)

口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的，是一種主要感染包括豬、牛、綿羊、山羊、鹿等在內(nèi)70多種的偶蹄獸的烈性傳染病，對畜牧業(yè)危害巨大，被世界衛(wèi)生組織列為A類傳染病，在我國也被列為一類傳染病，同時它也是一種人獸共患病?？谔阋卟《緦儆谛NA病毒科，口蹄疫病毒屬，為二十面體對稱的無囊膜的單股正鏈RNA病毒粒子，直徑為26nm，口蹄疫病毒的基因約8500個核苷酸組成。口蹄疫的臨床診斷比較困難，如在山羊和綿羊上，其臨床癥狀不明顯，一些種類的動物感染的口蹄疫病毒毒力較低，另外，一些病毒水泡病，如豬的水泡病、水皰性口炎病毒感染，不能單從臨床上將其與口蹄疫區(qū)分開來。因此，確診口蹄疫需要進(jìn)行實驗室診斷，快速而精確地對口蹄疫進(jìn)行檢測診斷，對于口蹄疫的防制具有重大的意義，目前，應(yīng)用于口蹄疫實驗室診斷的方法種類較多，主要包含免疫學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷兩方面。

1 口蹄疫的實驗室診斷

1.1 病毒的分離

采集患病動物的水泡皮、水泡液、鼻拭子、食道一咽部刮取物、抗凝血或血清、牛奶等樣品。對于死亡動物，可采集其淋巴結(jié)、扁桃體、脊髓及心臟等樣品。采集的樣品應(yīng)冰凍保存，或置于pH值為7.2～7.6的甘油緩沖液中。

病毒的分離可采用細(xì)胞培養(yǎng)法和動物接種法。細(xì)胞培養(yǎng)法的原理是將分離口蹄疫病毒接種在豬的腎細(xì)胞、PK-l5、倉鼠腎細(xì)胞等細(xì)胞系中，培養(yǎng)一段時間后將病毒從培養(yǎng)細(xì)胞中拯救出來，并測定其TCID50。接種動物時，常用的實驗動物是乳鼠，需要接種8～l0只。雖然，通過接種動物可以順利地分離出口蹄疫病毒。但是，其缺點是需要在生物安全三級實驗室中進(jìn)行試驗，而且試驗環(huán)境要求也極為嚴(yán)格。

1.2 血清學(xué)診斷

1.2.1 補體結(jié)合試驗

補體結(jié)合試驗是利用已知的抗原（或抗體）、被檢的抗體（或抗原），紅細(xì)胞、溶血素兩個系統(tǒng)競爭補體的原理而建立的一種檢測方法。其優(yōu)點是能對口蹄疫病毒進(jìn)行分型鑒定，結(jié)果判定直觀、可靠。本試驗的缺點是易受樣品質(zhì)量的影響和樣品中親補體和抗補體物質(zhì)的干擾，操作程序也較為復(fù)雜。

1.2.2 ELISA

ELISA的原理是向吸附有抗原（或抗體）的固相載體中加入待測抗體（或抗原），再加入相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體（或抗原），生成抗原（或抗體）——待測抗體（或抗原）——酶標(biāo)記抗體（或抗原）復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色底物，借助分光光度計計算抗體（或抗原）的量。目前，用于口蹄疫診斷的ELISA主要有液相阻斷ELISA、間接ELIA、固相競爭ELISA、夾心ELISA四種。

（1）液相阻斷ELISA

此方法的優(yōu)點是快速、敏感、準(zhǔn)確，在一般實驗室操作即可進(jìn)行；缺點是檢測結(jié)果中有一定的假陽性，需將檢測結(jié)果中陰性和可疑的血清樣品再用中和試驗進(jìn)行進(jìn)一步的確診。

（2）間接ELISA

間接ELISA是利用2C、3AB、3ABC及3D等口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白做診斷抗原來區(qū)分免疫動物血清抗體和自然感染動物血清抗體。其優(yōu)點是特異性、準(zhǔn)確性高，不足之處是操作過程略顯繁瑣。

（3）固相競爭ELISA

固相競爭ELISA只需將濃縮的、半純化的滅活全病毒146S作為抗原，檢測口蹄疫病毒的抗體。其優(yōu)點是特異性高、假陽性率低，不足之處是操作繁瑣。

（4）夾心ELISA

夾心ELISA方法優(yōu)點是快速、敏感、準(zhǔn)確，在檢測田間樣品時，敏感性高于補體結(jié)合試驗。其缺點是實驗條件要求高，檢測過程需要在特殊的實驗室進(jìn)行。

1.2.3 病毒中和試驗

其原理是利用血清中和抗體與口蹄疫病毒發(fā)生特異性結(jié)合，從而使口蹄疫病毒喪失對易感動物和敏感細(xì)胞的感染力。中和試驗的優(yōu)點是既可以鑒定抗原，又可以對血清抗體進(jìn)行定量測定，缺點是需要培養(yǎng)單層細(xì)胞或飼養(yǎng)實驗動物。

1.2.4 間接血凝試驗

（1）正向間接血凝試驗

其原理是將滅活的各型病毒致敏由綿羊紅細(xì)胞制備的診斷試劑，當(dāng)其與之相應(yīng)的血清型的血清反應(yīng)時即可發(fā)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。其優(yōu)點是試驗設(shè)備簡單、操作簡便、靈敏度高，能大規(guī)模的檢測血清中的抗體。缺點是不同批號的產(chǎn)品效價有波動。

（2）反向間接血凝試驗

其原理是將口蹄疫病毒的抗體以化學(xué)方法偶聯(lián)于醛化的綿羊紅細(xì)胞上，當(dāng)貼附于血球的抗體與游離的抗原相遇并形成抗原-抗體凝集網(wǎng)絡(luò)時，綿羊紅細(xì)胞也隨之凝集，出現(xiàn)了肉眼可見的血球凝集現(xiàn)象。其優(yōu)點是簡單、快捷，適合于基層使用，是我國口蹄疫病毒鑒定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。缺點是檢測結(jié)果的人為主觀性強(qiáng)。

1.2.5 非結(jié)構(gòu)蛋白抗體試驗

病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白不形成其衣殼蛋白。進(jìn)行非結(jié)構(gòu)抗體試驗時，鑒別診斷的依據(jù)是：目前使用的口蹄疫疫苗主要為滅活疫苗或亞單位疫苗，在動物體內(nèi)不會出現(xiàn)病毒增殖，因此，病毒特異性非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）不能表達(dá)產(chǎn)生NSP抗體。而自然感染動物后，則有病毒增殖，有NSP抗體產(chǎn)生。因此，可以利用是否檢測到NSP抗體來區(qū)分自然感染動物與疫苗免疫動物。目前，我國已經(jīng)建立了檢測3ABC抗體的ELISA方法，并廣泛應(yīng)用干臨床檢測。

此方法的優(yōu)點：（1）試劑和樣品用量極小，可以低至1～2μl；（2）無需熒光顯微鏡和酶標(biāo)檢測儀等儀器，非常適合現(xiàn)場使用；（3）沒有有害物質(zhì)（如放射性同位素、鄰苯二胺等）的參與；（4）檢測時間較短，1～5 min就可以得到結(jié)果，并可長期保存；（5）膠體金的敏感性可達(dá)到ELISA水平，若結(jié)合銀染色則檢測的敏感性可大大提高。其缺點是免疫層析快速診斷試紙條對疾病的檢測屬于定性檢測，結(jié)果只有陰性和陽性，判定結(jié)果往往帶有主觀性。2008年，蔣韜等人通過將純化的口蹄疫流行株O/ China99、A/AF72、AsiaⅠ/China05 抗體和羊抗豚鼠抗體分別包被在硝酸纖維素膜上，作為檢測帶與質(zhì)控帶，組裝形成膠體金定型診斷試紙條，能夠?qū)谔阋卟《具M(jìn)行快速、靈敏、特異的診斷。2009，林彤等人采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記純化的抗Asia1 型口蹄疫病毒的單克隆抗體，將該標(biāo)記物與羊抗豚鼠IgG 分別包被在硝酸纖維素膜上，作為檢測帶和質(zhì)控帶，組裝成檢測Asia1 型口蹄疫的診斷試紙條，也能快速、靈敏、特異的診斷口蹄疫病毒。

1.3 分子生物學(xué)診斷

1.3.1 RT-PCR

RT-PCR的原理是將單鏈RNA病毒的核酸序列反轉(zhuǎn)錄成雙鏈，然后再擴(kuò)增雙鏈核酸和進(jìn)行電泳試驗，最后通過觀察目的條帶的大小來進(jìn)行診斷。該方法利用TaqMan技術(shù)，選擇3D基因區(qū)設(shè)計了一組特異的引物和探針，可快速檢測O、A、C及Asia I型口蹄疫病毒，且可對病毒進(jìn)行定量檢測，具有高度的特異性和實時性。其優(yōu)點是耗時較短、敏感性高、特異性強(qiáng)，利于快速、準(zhǔn)確地診斷出口蹄疫。缺點是需要提取口蹄疫病毒的RNA，需要在特定的實驗室進(jìn)行檢測，不利于現(xiàn)場對口蹄疫進(jìn)行診斷。2007年，Andrew E. Shaw等人設(shè)計出了一步診斷口蹄疫的RT-PCR的方法，相較于兩步法，其檢測的敏感性有所提高，但當(dāng)口蹄疫病毒滴度太低時，也不能準(zhǔn)確的檢測。

1.3.2 熒光定量PCR

所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR的關(guān)鍵是使用了熒光探針及其相應(yīng)的熒光信號檢測裝置，其檢測方法可分為兩類：一類是非特異性的雙鏈DNA嵌入染料，如SYBR Green I；另一類是以雜交形式進(jìn)行的單鏈檢測系統(tǒng)，有水解探針（如Taq-Man）、雜交探針、分子信標(biāo)、熒光標(biāo)記引物等。熒光定量PCR的優(yōu)點：（1）解決了傳統(tǒng)PCR方法耗時長、單次檢測的樣品受限、判定的結(jié)果具有主觀性等不足；（2）由于實時熒光定量PCR技術(shù)有定量檢測功能，擴(kuò)大了傳統(tǒng)PCR方法的應(yīng)用領(lǐng)域。缺點：（1）由于減少了擴(kuò)增后電泳的檢測步驟，因此，不能檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小；（2）因為熒光素種類以及檢測光源的局限性，從而相對地限制了其復(fù)合式檢測的應(yīng)用能力；（3）熒光定量PCR實驗成本比較高。

1.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）

LAMP的原理與RT-PCR相似之處是，都需要通過擴(kuò)增目的基因片段，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳實驗，最后觀察產(chǎn)物條帶的方法來進(jìn)行診斷。與RT-PCR相比，LAMP技術(shù)具有以下優(yōu)點：（1）敏感性高。它能從極低微量的拷貝中擴(kuò)增出目的基因片段，這比傳統(tǒng)PCR高出10～1000倍，同時還具有與RT- PCR同樣的敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)，加環(huán)引物的敏感性要比沒有加環(huán)引物的高出7個數(shù)量級，即使模板量為0.01 PFu時，也可獲得檢測結(jié)果。（2）特異性好。通過對人流感病毒和人皰疹病毒等病毒的研究結(jié)果表明，LAMP不僅能對多血清型的同一病原體進(jìn)行定型，而且不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。（3）簡便。由于LAMP是在等溫的條件下進(jìn)行的，所以在進(jìn)行實驗室診斷時，只需要水浴鍋或其他等溫設(shè)備即可，而不需要PCR等實驗的昂貴儀器。（4）快速。通常只需要30～60min即可得到檢測結(jié)果。（5）易于判定試驗結(jié)果。判定結(jié)果時，不需要進(jìn)行電泳，只需要肉眼觀察擴(kuò)增管的濁度或通過向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料觀察其顏色變化即可。（6）可與反轉(zhuǎn)錄結(jié)合，對RNA分子進(jìn)行擴(kuò)。

1.3.4 核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是通過將同位素標(biāo)記的FMDV基因組序列作為探針，然后與口蹄疫基因組RNA特定區(qū)域進(jìn)行反應(yīng)而建立的檢測方法。1998年，Rossi等用P32標(biāo)記克隆在質(zhì)粒上的口蹄疫病毒基因組聚合酶序列作為探針，檢測感染口蹄疫病毒牛的食道一咽部刮取物即可。其優(yōu)點是快速、準(zhǔn)確。不足之處是要求用活毒進(jìn)行檢測，對實驗室要求較高。

2 討論

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是目前檢測FMDV感染較為常用的診斷方法，其與間接血凝抑制試驗、免疫擴(kuò)散沉淀試驗等檢測方法相比，具有靈敏、快速、價廉等優(yōu)點?？谔阋邫z測技術(shù)在臨床上廣泛使用的主要是無生物安全要求的血清學(xué)診斷技術(shù)，如液相阻斷ELISA、非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELSIA等。前者主要用于動物疫苗免疫抗體監(jiān)測，評價疫苗免疫動物抗體水平；后者主要用于FMD感染和人工免疫的鑒別診斷，區(qū)分免疫動物和自然感染動物是防治FMD的一項重要工作，通過血清學(xué)檢測能了解畜群的FMD的免疫抗體合格情況和感染狀況。RT-PCR主要是用于口蹄疫疫情爆發(fā)時采集組織樣品的病原學(xué)診斷，并可以區(qū)分0型、A型和亞洲I型，對口蹄疫的防控提供重要的技術(shù)支撐。