李 穎，張秀麗，汪 卓

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001;2濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系;3東北大學(xué)生命與健康學(xué)院)

青光眼是一類以視神經(jīng)損傷和視野缺損為特征的眼病，已成為不可逆性致盲眼病的第二位疾病，其主要機(jī)制與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)凋亡和神經(jīng)纖維的丟失有關(guān)，因此對于RGC的保護(hù)和再生治療成為當(dāng)今眼科研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。人參是傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，人參皂苷是人參中的主要有效成分。實(shí)驗(yàn)研究表明，人參皂苷Rb1對H2O2誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞有保護(hù)作用［1］。2014年5～8月，我們觀察了人參皂苷Rb1對H2O2損傷RGC-5細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 H2O2、人參皂苷 Rb1、Fluo-3/AM(Molecular Probe)、Caspase-3抗體、SABC 試劑盒(武漢博士德);谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);胎牛血清(杭州四季青生物材料工程研究所);DMEM(Gibco公司)。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，熒光顯微鏡。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) RGC-5細(xì)胞采用10%胎牛血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每3～5 d后通過胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活力觀察 RGC-5細(xì)胞以1×105/mL接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)分為5組，E組不制備H2O2損傷模型，也不干預(yù);A、B、C組提前30 min加入0.05、0.1、0.2 mmol/L 人參皂苷 Rb1，A、B、C、D組均加入0.2 mmol/L H2O2誘導(dǎo)氧化損傷24 h，加入終濃度0.5 mg/mL的MTT，37℃孵育4 h后，加入DMSO 100 μL，采用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測細(xì)胞OD值(代表細(xì)胞活力)。

1.4 細(xì)胞GSH含量、SOD活性檢測 RGC-5細(xì)胞以1×105/mL接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，空白對照組不制備H2O2損傷模型，也不干預(yù);人參皂苷Rb1組提前30 min加入0.1 mmol/L人參皂苷Rb1，人參皂苷Rb1組及H2O2損傷組均加入H2O2誘導(dǎo)氧化損傷24 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入細(xì)胞裂解液100 μL，冰上裂解30 min后，收集上清液并離心，按照GSH含量測試盒說明書設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和測定孔，分別加入不同試劑混勻，靜置5 min，在405 nm處，采用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值。按照SOD活性測試盒說明書分別設(shè)置對照孔、對照空白孔和測定孔，三孔分別加入不同試劑混勻，37℃孵育20 min，450 nm處酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值。

1.5 細(xì)胞Caspase-3蛋白檢測 分組及各組干預(yù)(方法同1.4)后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，4%的多聚甲醛固定室溫10 min，棄固定液后PBS洗滌3次，0.5%Triton-100室溫穿孔5 min，PBS洗滌3次，1%BSA室溫封閉30 min，加入1∶500的 Caspase-3一抗，于37℃孵育2 h，PBS洗滌3次，按照 SABC說明書加入二抗及熒光試劑，同時(shí)加入4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚，熒光顯微鏡下觀察Caspase-3免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，計(jì)算免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞百分率(陽性細(xì)胞百分率 =陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù) ×100%)。

1.6 細(xì)胞 Ca2+檢測 分組及各組干預(yù)(方法同1.4)后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，各組細(xì)胞用5 μmol/L Ca2+熒光探針Fluo-3在37℃孵育1 h后，熒光顯微鏡下觀察Ca2+熒光強(qiáng)度，并計(jì)算陽性細(xì)胞百分率(陽性細(xì)胞百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.7 碘化丙啶(PI)染色細(xì)胞檢測 分組及各組干預(yù)(方法同1.4)后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，加入終濃度為0.05 mg/mL的PI，室溫染色15 min，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光的細(xì)胞，并計(jì)算陽性細(xì)胞百分率(陽性細(xì)胞百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力比較 A、B、C、D、E組在490 nm處OD 值分別為 0.266 ±0.038、0.299 ±0.025、0.314 ±0.014、0.222 ±0.031、0.391 ±0.041，A、B、C、E 組與 D 組比較，P 均 ＜0.05。

2.2 各組細(xì)胞SOD活性、GSH含量比較 空白對照組、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組SOD活性分別為(19.88 ±0.12)、(17.12 ±0.32)、(15.47 ±0.21)U/mgprot，人參皂苷 Rb1組、空白對照組分別與H2O2損傷組比較，P均＜0.05?？瞻讓φ战M、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組GSH含量分別為(15.67±0.18)、(14.98 ± 0.25)、(13.71 ± 0.31)μmol/gprot，人參皂苷Rb1組、空白對照組分別與H2O2損傷組比較，P 均 ＜0.05。

2.3 各組細(xì)胞Caspase-3蛋白比較 空白對照組、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組Caspase-3陽性率分別為 12% ±0.25%、57% ±0.47%、28% ±0.18%，人參皂苷Rb1組與H2O2損傷組比較，P＜0.05。

2.4 各組細(xì)胞PI染色陽性率比較 空白對照組、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組細(xì)胞染色陽性率分別為16% ±0.25%、18% ±0.45%、32% ±0.56%，人參皂苷Rb1組與H2O2損傷組比較，P＜0.05。

2.5 各組細(xì)胞Ca2+水平比較 空白對照組、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組細(xì)胞Ca2+熒光染色陽性率分別為 8% ±0.11%，31% ±1.20%，19% ±0.34%，人參皂苷Rb1組與H2O2損傷組比較，P＜0.05。

3 討論

目前認(rèn)為，青光眼致視功能損害的共同病理基礎(chǔ)是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的進(jìn)行性死亡和神經(jīng)纖維丟失，導(dǎo)致不可逆性視神經(jīng)萎縮和視野改變，構(gòu)成青光眼的最終改變，氧化應(yīng)激引起的RGC凋亡是重要原因之一［2］。研究［3，4］表明，氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)體外 RGC細(xì)胞Casepase依賴性的凋亡。H2O2是有機(jī)體氧化代謝產(chǎn)物，是一種活性氧，能直接氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)及蛋白，能自由穿過細(xì)胞膜細(xì)胞內(nèi)離子反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的自由基，H2O2在體外能誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，因此被廣泛用于各種急性和(或)慢性氧化損傷模型［5，6］。

人參是一種傳統(tǒng)的藥物，人參皂苷Rb1是近年來研究較多的一類人參單體，其具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增強(qiáng)記憶力等功效［7，8］。研究［9，10］表明，人參皂苷 Rb1 可明顯減少 Aβ25-35 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對神經(jīng)細(xì)胞的缺血性損傷有保護(hù)作用。由于H2O2在體外能誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，當(dāng)機(jī)體內(nèi)H2O2增多或者清除能力減弱時(shí)，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。本研究顯示，隨著H2O2濃度的增高，細(xì)胞的存活率降低，當(dāng)H2O2濃度為0.2 mmol/L時(shí)細(xì)胞活力最大。通過人參皂苷Rb1干預(yù)后，細(xì)胞活力明顯提高，提示人參皂苷Rb1對氧化損傷具有保護(hù)作用。

機(jī)體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)包括酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，SOD是抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，通過歧化的方式清除超氧自由基，而GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑［11］。因此，檢測SOD活性和GSH含量可反映機(jī)體的過氧化程度。本研究顯示，人參皂苷Rb1組SOD活性、GSH含量較空白對照組降低，較H2O2損傷組升高，提示這個(gè)可能是人參皂苷Rb1的保護(hù)機(jī)制之一。ROS可氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，脂質(zhì)的過氧化物進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)的Ca2+失衡［12，13］。細(xì)胞內(nèi)鈣超載在細(xì)胞凋亡的過程中起關(guān)鍵作用。鈣超載及其所觸發(fā)的一系列有害代謝是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的“最后共同通路”細(xì)胞內(nèi)鈣超載可使一些參與細(xì)胞凋亡的Ca2+依賴性蛋白酶激活，導(dǎo)致生物膜損傷［14］。本研究顯示，人參皂苷Rb1組Ca2+水平較空白對照組降低，較H2O2損傷組升高，提示人參皂苷Rb1可能是通過細(xì)胞Ca2+的調(diào)節(jié)對H2O2損傷RGC-5起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用PI染色觀察H2O2是否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因?yàn)镻I不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，而對壞死的細(xì)胞由于細(xì)胞膜的完整喪失而被著色。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)H2O2作用RGC-5細(xì)胞后，PI染色的細(xì)胞明顯增多，說明H2O2對RGC-5細(xì)胞具有明顯的損傷作用，加入人參皂苷Rb1干預(yù)后PI染色的細(xì)胞明顯減少，說明人參皂苷Rb1具有抗凋亡的作用。凋亡是一種受基因調(diào)控的程序性死亡，Caspase是天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白水解酶是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的蛋白酶家族，通常以無活性的酶原形式存在［15］。Caspase-3是Caspase家族中最為重要的凋亡執(zhí)行者之一［16］，是最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，當(dāng)被活化后，酶解、切割特異性底物如DNA依賴性蛋白激酶等，改變其結(jié)構(gòu)或影響特定信號分子而引起細(xì)胞凋亡［17］。研究［18，19］表明，高濃度 H2O2能使 Caspase-3 活化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究顯示，H2O2誘導(dǎo)損傷RGC-5細(xì)胞后，Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯增多，而人參皂苷Rb1能抑制Caspase-3陽性表達(dá)率，提示人參皂苷Rb1通過減低Caspase-3的活化進(jìn)而抑制H2O2誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞的凋亡。

總之，人參皂苷Rb1能夠拮抗H2O2對RGC-5細(xì)胞的氧化損傷，其機(jī)制可能為提高SOD活性和GSH含量，降低Caspase-3的表達(dá)，減少Ca2+水平。

［1］許浩，葛亞坤，鄧同樂，等.人參皂苷Rb1對H2O2誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2005，21(7):803-806.

［2］Ameri H，Ratanapakorn T，Rao NA，et al.Natural course of experimental retinal vein occlusion in rabbit.arterial occlusion following venous photothrombosis［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2008，246(10):1429-1439.

［3］Guo D，Bi H，Liu B，et al.Reactive oxygen species-induced cytotoxic effects of zinc oxide nanoparticles in rat retinal ganglion cells［J］.Toxicol In Vitro，2013，27(2):731-738.

［4］Guo D，Bi H，Wu Q，et al.Zinc oxide nanoparticles induce rat retinal ganglion cell damage through bcl-2，caspase-9 and caspase-12 pathways［J］.J Nanosci Nanotechnol，2013，13(6):3769-3777.

［5］Cao CZ，Bu LS，Gao S，et al.The injured effect of hydrogenperoxide oncultured cardiac myocytes［J］.Prog Biochem Biophys，2000，27(6):628-632.

［6］Lavinsky D，Cardillo JA，Mandel Y，et al.Restoration of retinal morphology and residual scarring after photocoagulation［J］.Acta Ophthalmol，2013，91(4):e315-323.

［7］ Chen XC，Zhou YC，Chen Y，et al.Ginsenoside Rg1 reduces MPTP2 induced substantia nigra neuron loss by suppressing oxidative stress［J］.Acta Pharmacol Sin，2005，26(1):56262.

［8］Li YK，Chen XC，Zhu YG，et al.Ginsenoside Rb1 attenuates okadaicacid induced Tau protein hyperphosphorylation in rat hippocampal neurons［J］.Acta Physiologica Sinica，2005，57(2):4873.

［9］趙慶霞，許燕，鄢文海，等.人參皂苷Rb1對Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制作用觀察［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(30):29-30.

［10］劉忞，張均田.人參皂苷Rb1和Rg1對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995，30(9):674-768.

［11］Morooka H，Hirotsune N，Wani T，et al.HistochemiCal demollSlration offree radicals(H2O2)in ischemic brain edema and Protective effects of human recombinant superoxide dismutase on ischemic neuronal damage［J］.Acta Neurochir SuPPI(Wien)，1994，(60):307-309.

［12］Santanam N，Ramachandran S，Parthasarathy S.Oxygen radicals，antioxidants，and lipid perox idation［J］.Semin Reprod Endocrinol，1998，16(4):275-280.

［13］Camandola S，PoliG，Mattson MP.The lipid peroxidation product4-hydroxy-2，3-nonenal increases AP-1-binding activity throughcaspase activation in neurons［J］.J Neurochem，2000，74(1):159-168.

［14］Matsude T，Arakawa N，Takuma K，et al.SEA0400，a novel and selective inhibitor of the Na+-Ca2+exchanger，attenuates reperfusion injury in the vitro and in vivo cerebal ischemic models［J］.J Phamacol Exp Ther，2001，298(1):249-556.

［15］楊紹杰，孟金萍，屈祎，等.細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路的研究進(jìn)展［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(5):297-301.

［16］Shaw RD，Hempson SJ，Mackow ER，et al.Rotavirus infection in lambs:pathogenesis and pathology［J］.Arch Virol，1977，55(4):263.

［17］Yakovlev AG，Knoblach SM，F(xiàn)an I，et al.Activation of CPP32 like Caspases contributes to Neuronal apoptosis and neurological dysfunction after traumatic brain injury［J］.J Neurosci，1997，17(19):7415-7424.

［18］Kwon SH，Kim JA，Hong SI，et al.Loganin protects against hydrogen peroxide-induced apoptosis by inhibiting phosphorylation of JNK，p38，and ERK1/2 MAPKs in SH-SY5Y cells［J］.Neurochem Int，2011，58(4):533-541.

［19］Jia LQ，Yang GL，Ren L，et al.Tanshinone IIA reduces apoptosis induced by hydrogen peroxide in the human endothelium-derived EA.hy926 cells［J］.J Ethnopharmacol，2012，143(1):100-108.