丙型肝炎病毒基因型與丙型肝炎患者自身抗體的相關(guān)性

王笑顏，鄒偉華，邵圣文，錢福初，王　翔

(湖州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖州師范學(xué)院微生物與免疫學(xué)研究室，浙江湖州 313000)

丙型肝炎由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起。HCV可直接損傷肝細(xì)胞，同時(shí)還伴有免疫系統(tǒng)損傷和肝外病變，成人感染HCV后有60%～80%會(huì)發(fā)展為慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)。HCV為單股正鏈RNA病毒，其基因序列呈現(xiàn)多態(tài)性和高度變異性。近年來(lái)，Simmonds等[1]根據(jù)HCV基因組序列分型法，將HCV分為6種基因型和31種亞型。初步證據(jù)表明，HCV感染與自身免疫關(guān)系密切。本文就HCV不同基因型感染與自身抗體變化的關(guān)系進(jìn)行研究，有助于探討HCV發(fā)病機(jī)制和其感染對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，為臨床治療提供依據(jù)。

資料和方法

對(duì)象及樣本分組

湖州市中心醫(yī)院2008年1月至2010年1月傳染科門診和住院患者中HCV RNA陽(yáng)性患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合全國(guó)病毒性肝炎防治方案[2]，所有患者排除甲、乙、丁、戊型肝炎病毒感染?？共《局委熐俺槿§o脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清置-70℃凍存?zhèn)溆谩?duì)照組為本院健康體檢者，均HCV RNA<8×104/L。

血清樣本按照HCV RNA病毒載量分為3組，HCV RNA≥108/L為高病毒載量組，108～105/L為中載量組，105～8×104/L為低載量組。

試劑與方法

HCV RNA檢測(cè)：定量檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量法，由廣東達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的HCV熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)。HCV基因擴(kuò)增采用Trizol法提取病毒RNA參考文獻(xiàn)[3]，以RT-nest PCR擴(kuò)增HCV RNA 5′-NCR區(qū)，引物委托美國(guó)Invitrogen上海公司合成。在EPPENDORF mastecycler PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，取10 μl RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到互補(bǔ)cDNA，-70℃保存。第一輪PCR擴(kuò)增：以5 μl互補(bǔ)cDNA為模板，以外引物進(jìn)行擴(kuò)增，參數(shù)為94℃變性10 min，94℃ 1 min，54℃ 1 min 50 s 72℃ 1 min，共25個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min延伸。第二輪PCR擴(kuò)增：取第一輪PCR產(chǎn)物2 μl為模板，以內(nèi)引物擴(kuò)增，參數(shù)為94℃變性10 min，94℃ 1 min 55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)72℃ 10 min延伸。取第二輪PCR產(chǎn)物5 μl，2.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察鑒定。HCV序列測(cè)定及基因分型PCR產(chǎn)物測(cè)序由迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心以ABI3130全自動(dòng)測(cè)序儀完成。將測(cè)序結(jié)果輸入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因分型軟件，經(jīng)比對(duì)后獲得基因分型結(jié)果(分型軟件網(wǎng)址參見(jiàn)www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)。

自身抗體檢測(cè)：采用間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)、抗平滑肌抗體(anti-smooth muscle antibodies，ASMA)。采用斑點(diǎn)免疫印跡法檢測(cè)抗線粒體抗體M2、Sm、RO52、SSA、SSB及抗著絲點(diǎn)抗體(centromere antibody，CENPB)。以上檢測(cè)試劑均由德國(guó)歐蒙公司提供。待測(cè)血清1∶100為起始稀釋度，檢測(cè)陽(yáng)性血清分別進(jìn)行1∶320、1∶1000、1∶3200稀釋度以確定最終滴度。類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)采用散射比濁法，在Beckman-Immage儀器上檢測(cè)，試劑由美國(guó)貝克曼公司提供。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SSPS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

基本資料

HCV RNA陽(yáng)性者94例，男55例，女39例；年齡15～79歲；CHC 89例，丙型肝炎后肝硬化5例，所有患者抗HCV-抗體均為陽(yáng)性。對(duì)照組70例，男32例，女38例；年齡23～66歲。

HCV基因型分布

94例HCV RNA陽(yáng)性者中，1a型5例(5.3%)，1b型77例(81.9%)，2a型9例(9.6%)，3a型1例(1.1%)，6a型2例(2.1%)。

自身抗體檢出率

94例HCV RNA陽(yáng)性者共檢出37例(37/94，39.4%)自身抗體陽(yáng)性；其中1b型檢出36例自身抗體陽(yáng)性者，檢出率為46.8%(36/77)；2a型檢出1例自身抗體陽(yáng)性，檢出率為11.1%(1/9)，兩者檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他基因型未檢出自身抗體陽(yáng)性。

36例自身抗體陽(yáng)性1b型者ANA陽(yáng)性36例次，RF陽(yáng)性21例次，SSA陽(yáng)性8例次，RO52陽(yáng)性8例次，SSB陽(yáng)性7例次，M2陽(yáng)性5例次，CENPB陽(yáng)性4例次，ASMA陽(yáng)性3例次。1例自身抗體陽(yáng)性2a型者，表現(xiàn)為ANA、RF及M2陽(yáng)性。

HCV基因型與ANA的關(guān)系

94例HCV RNA陽(yáng)性者中，ANA陽(yáng)性者37例。滴度1∶100者占59.5%(22/37)，滴度1∶320者21.6%(8/37)，滴度1∶1000者占18.9%(7/37)。ANA熒光圖型檢測(cè)結(jié)果以顆粒型為主，占62.2%(23/37)，其次是絲點(diǎn)型(16.2%，6/37)，其他為核仁型和均質(zhì)型。

HCV病毒載量與ANA檢出率的關(guān)系

94例HCV RNA陽(yáng)性者中，高、中、低載量組分別為20、38、36例。3個(gè)載量組分別與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為6.4、19.9、53.1，均P<0.05)。高載量組和低、中載量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為19.5、9.8，均P<0.05)(表1)。

討　　論

多種病毒感染可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。1989年Esterban等[4]在自身免疫性肝炎患者血清中檢出ANA，隨后HCV感染與自身免疫的關(guān)系引起廣泛關(guān)注[5]。HCV感染可通過(guò)分子模擬現(xiàn)象激活自身免疫反應(yīng)性CD8+細(xì)胞，從而導(dǎo)致自身免疫[6]。

HCV基因組呈現(xiàn)高度變異性，這是HCV感染容易導(dǎo)致慢性化的主要原因。目前Simmonds等將HCV分為6個(gè)基因型，鄒偉華等[7]采用RT-nest PCR后直接測(cè)序法分析不同丙型肝炎患者血清HCV基因型。本研究結(jié)果顯示，湖州地區(qū)流行的HCV基因型主要為1b型，其次為2a型，與國(guó)內(nèi)主要流行趨勢(shì)相一致。本研究檢測(cè)了湖州地區(qū)不同HCV基因型患者體內(nèi)自身抗體情況，結(jié)果表明1b型患者檢出率為46.8%，與國(guó)內(nèi)已有報(bào)道[8]相近。2a型檢出率為11.1%，其他基因型均未檢出自身抗體。這與國(guó)外報(bào)道不一致，Zein等[9]報(bào)道1a型HCV感染與自身免疫的相關(guān)性較為明顯，1b型HCV感染次之。這可能是由于研究對(duì)象種族不同造成的。葛明才等[10]研究表明，1b型HCV感染確與自身免疫明顯相關(guān)，提示HCV感染可能可誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，另外，研究還提示這種免疫反應(yīng)與疾病嚴(yán)重程度及病程長(zhǎng)短有關(guān)。

表1　丙型肝炎病毒RNA含量與抗核抗體檢出率

本文觀察到，94例不同基因型丙型肝炎患者中，1b型可檢出ANA、RF、ASMA、M2、SSA、RO52、SSB、CENPB這8種自身抗體，2a型檢出ANA、RF和M2這3種自身抗體。有研究認(rèn)為，自身免疫疾病的啟動(dòng)因子是病毒感染，靶細(xì)胞中的抗原成分改變或者由于病毒蛋白正常組織成分間有同源性而誘發(fā)自身免疫，并認(rèn)為HCV感染可通過(guò)分子模擬現(xiàn)象激活自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)自身免疫[11]。本文還觀察到，1b型和2a型HCV-RNA自身抗體以低滴度為主。然而，一般認(rèn)為自身抗體在高滴度時(shí)才與自身免疫病密切相關(guān)。當(dāng)前，HCV治療主要應(yīng)用α-干擾素，該藥可誘導(dǎo)或增強(qiáng)自身免疫，存在高滴度自身抗體者應(yīng)用時(shí)可能會(huì)使病情惡化。另外，自身免疫性疾病可應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物治療，但該類藥物可促進(jìn)病毒復(fù)制。張路等[12]認(rèn)為，慢性HCV感染相關(guān)的自身免疫性疾病在臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查特征上與未合并慢性HCV感染者相比無(wú)差異，使用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑治療仍安全有效。有學(xué)者認(rèn)為，給予ANA滴度<1∶320者應(yīng)用α-干擾素治療后不會(huì)出現(xiàn)病情惡化[13]。因此，對(duì)低滴度自身抗體的HCV患者，不應(yīng)推遲干擾素的治療；而對(duì)于治療過(guò)程出現(xiàn)高滴度自身抗體的HCV患者，進(jìn)行自身抗體檢測(cè)和滴度監(jiān)測(cè)有助于了解患者自身免疫狀態(tài)并指導(dǎo)治療，對(duì)患者治療及愈后有重要臨床意義。

另外，也有研究表明，高滴度(≥1∶320)自身抗體常提示自身免疫性肝炎的存在[14]。本文檢測(cè)出的A-SMA和M2也是自身免疫性肝病的特征抗體，提示HCV患者可能合并自身免疫性肝炎。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著HCV病毒載量增加，ANA陽(yáng)性率也隨之增加，說(shuō)明ANA陽(yáng)性率與HCV病毒復(fù)制有關(guān)。Yuki等[15]檢測(cè)了71例HCV攜帶者，發(fā)現(xiàn)ANA在高病毒血癥(108～109copies/ml)中為陽(yáng)性，提出自身抗體的出現(xiàn)可能與病毒的高水平復(fù)制有關(guān)。因此，當(dāng)HCV患者自身抗體陽(yáng)性，可能提示肝臟和免疫系統(tǒng)同時(shí)受累，此時(shí)病毒可能處于高復(fù)制狀態(tài)，應(yīng)選擇合理治療方案，做到既能控制病毒復(fù)制，也不累及免疫系統(tǒng)?？傊?，丙型肝炎患者自身抗體與HCV基因型有關(guān)，對(duì)其開(kāi)展自身抗體檢測(cè)有利于HCV治療。

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