噬菌體治療中細(xì)菌對噬菌體的抗性

蔡劉體 陳興江 劉艷霞 石俊雄

（貴州省煙草科學(xué)研究院 中國煙草分子遺傳重點實驗室，貴陽 550081）

用抗生素治療細(xì)菌性病原菌感染已經(jīng)有幾十年歷史，而且是非常好的有效治療。然而，隨著抗生素的廣泛使用，包括正常的和不正常的使用，對細(xì)菌性病原菌而言已經(jīng)形成了強(qiáng)大的選擇性壓力，致使細(xì)菌對抗生素出現(xiàn)了耐/抗藥性［1]。細(xì)菌通常只需要幾對基因就能對常用的抗生素產(chǎn)生耐/抗藥性，這些抗性基因通?？梢栽诩?xì)菌的遺傳元件例如共軛質(zhì)粒之間水平轉(zhuǎn)移［2]，而且一個單一的元件可以激發(fā)對不同抗生素的抗性［3]。此外，當(dāng)耐/抗藥性出現(xiàn)之后，即使在抗生素不存在的情況下，質(zhì)粒也可以在細(xì)菌群體中擴(kuò)散和保持，這種情況表明減少抗生素的使用也不太可能對耐/抗藥性情況有所幫助［4]。噬菌體（Bacteriophage，phage）是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，其中烈性噬菌體是細(xì)菌的天然“殺手”，具有殺死和清除細(xì)菌的能力。但是細(xì)菌也能獲得對噬菌體侵蝕的抵抗力，如在噬菌體附位點產(chǎn)生突變，或把噬菌體染色體整合到細(xì)菌基因組中，使得噬菌體對其失去感染能力。隨著耐/抗藥性細(xì)菌的增多，人們依然期望利用噬菌體治療作為替代傳統(tǒng)抗生素制劑的有效替代方法之一，也就是說選擇噬菌體治療耐/抗藥性細(xì)菌性病原菌的感染。

1 噬菌體治療的優(yōu)勢和難點

與抗生素治療相比較，利用噬菌體治療細(xì)菌性病害有其潛在優(yōu)勢：噬菌體只針對其特定的細(xì)菌病原菌作為宿主，因此噬菌體治療專一性強(qiáng)且無副作用，不會破壞正常菌群［5，6]；噬菌體的存活和復(fù)制都是依賴其宿主細(xì)菌，由于噬菌體復(fù)制數(shù)量大周期短，每個裂解周期都會產(chǎn)生大量的子代噬菌體，因此噬菌體制劑在治療中用量少，且具有放大效應(yīng)［7，8]。另外，對于已經(jīng)具有抗生素或化學(xué)農(nóng)藥耐/抗藥性的細(xì)菌性病原菌株系的感染，利用噬菌體治療尤其值得期望。

雖然噬菌體治療具有大的潛在優(yōu)勢，但是在噬菌體治療中也存在難點，尤其是在協(xié)同進(jìn)化中細(xì)菌對噬菌體產(chǎn)生抗性的問題。研究表明，在噬菌體的壓力驅(qū)動下，細(xì)菌能通過多種機(jī)制產(chǎn)生或獲得耐/抗性，包括已經(jīng)報道的吸附抑制、DNA 穿入阻滯、限制-修飾（Restriction-modification，R-M）系統(tǒng)、規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced palindromic repeats，CRISPR）系統(tǒng)及頓挫感染［9，10]，即使是在細(xì)菌數(shù)量相對比較小的群體中（如108的細(xì)菌數(shù)量），細(xì)菌能快速的對噬菌體產(chǎn)生抗性［11]。正因為人們對噬菌體治療的優(yōu)勢及前景的期望，同時也對細(xì)菌病原體對噬菌體抗性的擔(dān)心、噬菌體治療存在的爭議一致持續(xù)著。目前大家關(guān)注的一個問題是，雖然細(xì)菌對噬菌體產(chǎn)生抗性的機(jī)制和對化學(xué)抗生素產(chǎn)生抗性的機(jī)制有很大的區(qū)別。但是從長期治療的角度看會不會導(dǎo)致相同的結(jié)果：治療制劑不再能控制耐/抗性細(xì)菌病原菌的繁殖從而導(dǎo)致治療無效。

2 細(xì)菌對噬菌體抗性問題的爭議

在研究過程中，細(xì)菌對噬菌體抗性能快速的出現(xiàn)，此后噬菌體治療倡導(dǎo)者們通常利用混合噬菌體的優(yōu)點，在混合噬菌體中包含有多種類型的能感染同一種細(xì)菌或同一個細(xì)菌株系的噬菌體，從而使出現(xiàn)抗性細(xì)菌細(xì)胞的可能性大大降低［12，13]。然而，還有一個值得關(guān)注的問題是，混合噬菌體的廣泛使用是否會導(dǎo)致抗混合噬菌體的抗性細(xì)菌病原菌株系的產(chǎn)生，也許與抗生素使用結(jié)果相似，在噬菌體制劑使用了幾十年之后，可能出現(xiàn)眾多的細(xì)菌性病原菌對不同的混合噬菌體產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致噬菌體治療的困難［14]。正如Krylov等［15]最近建議，為防止具有廣譜性的混合噬菌體的細(xì)菌出現(xiàn)，在噬菌體治療中最好使用單一的裂解性、特異性感染病原菌的噬菌體。

通常認(rèn)為噬菌體驅(qū)動細(xì)菌的進(jìn)化［16]，在噬菌體的壓力下，迫使在細(xì)菌群體中產(chǎn)生對噬菌體具有適應(yīng)性的細(xì)菌，尤其是對噬菌體具有抗性的細(xì)菌。噬菌體一般宿主范圍比較窄，因此在一定程度上，通?？梢杂靡唤M特異性的噬菌體來區(qū)分相關(guān)性很近的細(xì)菌株系［17]。即使是宿主范圍窄，抗性的持續(xù)選擇和經(jīng)常提及的細(xì)菌與噬菌體之間的競爭性進(jìn)化［18]，也許可能使得分離有效感染具有多噬菌體抗性的細(xì)菌性病原菌株系變得困難。

在循環(huán)的協(xié)同進(jìn)化中，噬菌體能影響細(xì)菌的進(jìn)化［18]。在協(xié)同進(jìn)化中，細(xì)菌能獲得對噬菌體的抗性，形成對該噬菌體具有抗性的細(xì)菌，然而隨著協(xié)同進(jìn)化的循環(huán)，噬菌體能重新獲得對噬菌體具有抗性細(xì)菌的侵染能力，而且，研究表明細(xì)菌回復(fù)到噬菌體敏感型的頻率相對比較低［19，20]。細(xì)菌的細(xì)胞表面成分進(jìn)化比較快速，這可能是細(xì)菌細(xì)胞表面成分被噬菌體作為宿主附著點利用的原因，也是細(xì)菌病原菌改變其免疫系統(tǒng)的結(jié)果。研究表明即使在實驗室條件下，細(xì)菌與裂解性噬菌體的競爭性協(xié)同進(jìn)化會加速參與協(xié)同進(jìn)化物種之間的分子進(jìn)化速率［16]。雖然不是所有的噬菌體都能重新獲得感染抗性宿主的能力［18]，在這種協(xié)同進(jìn)化循環(huán)的情況下，只要噬菌體的宿主范圍不斷的演變，至少有一些噬菌體能具有感染細(xì)菌的能力［18]。

Orm?l?等［21]認(rèn)為，盡管上面提到的細(xì)菌對噬菌體能快速產(chǎn)生抗性，但是一些研究顯示具有噬菌體抗性的超級細(xì)菌不太可能出現(xiàn)。首先，在實驗室條件和在自然棲息地情況下，有實驗表明病毒（噬菌體）適應(yīng)進(jìn)化的宿主或者宿主適應(yīng)進(jìn)化的病毒（噬菌體）是周期性的演變。特別是Gomez 和Buckling［22]闡述土壤中的細(xì)菌對當(dāng)代噬菌體的抗性比對前代或者后代的噬菌體抗性要強(qiáng)。宿主對噬菌體感染的抗性只是細(xì)菌的一個暫時特性。同樣的，噬菌體對目前的細(xì)菌感染力比對過去或者以后的宿主的感染力弱。這表明不會因此使得只有協(xié)同進(jìn)化的噬菌體才能保持感染它們宿主的能力；反過來，這也表明噬菌體選擇不會驅(qū)動遺傳分化，還可以防止其它的噬菌體在特定的宿主中復(fù)制。另外，在很多情況下細(xì)菌獲得噬菌體抗性是有代價的［23，24]，對細(xì)菌而言，在其區(qū)域環(huán)境中不再出現(xiàn)的噬菌體，仍然對其保持噬菌體抗性是明顯不利的［22]。而且，具有噬菌體抗性的細(xì)菌通常缺失具有細(xì)菌性致病力的細(xì)胞表面特征［25，26]。具有噬菌體抗性的細(xì)菌，假使不被噬菌體殺死，大多也變成了無致病力的細(xì)菌。然而，有時候一直觀察不到細(xì)菌對噬菌體產(chǎn)生抗性的代價［27]，表明至少有些情況下細(xì)菌的抗性表現(xiàn)型可以持續(xù)。

大多數(shù)細(xì)菌被認(rèn)為是在它們目前的環(huán)境中與噬菌體競爭的條件下不斷進(jìn)化［11]。盡管這是一個事實，即使持續(xù)使用噬菌體致使一個細(xì)菌群體對特定的混合噬菌體有了永久性抗性，但是噬菌體感染模式的地理學(xué)研究表明新的感染性噬菌體仍然可以有效的使用。Flores等［28]通過分析38個關(guān)于宿主-噬菌體相互作用的獨立研究，結(jié)果表明噬菌體能感染許多從不同地方分離的宿主細(xì)菌株系，他們指出的噬菌體感染模式暗示“難被感染”的宿主被“通用”噬菌體感染而不是被專一性的噬菌體感染，這表明盡管它們?nèi)狈ψ罱慕佑|，但是噬菌體仍然能保持對地球另一端宿主細(xì)菌細(xì)胞的感染力。Wolf等［29]研究表明他們在2003年分離到能感染一個單一的淡水宿主細(xì)胞（鞘氨醇單胞菌）的噬菌體，宿主細(xì)胞是在1985年分離的，而噬菌體是在2003年從相距分離宿主細(xì)胞很遠(yuǎn)的地方分離的。Orm?l?等［21]從芬蘭分離的噬菌體中有可以感染20世紀(jì)60年代從不列顛分離的宿主。這些和其它例子表明一個單一的噬菌體能保持感染世界各地的宿主細(xì)菌，一個單一的細(xì)菌能作為多個遠(yuǎn)距離其它地方分離的噬菌體。

3 展望

以上關(guān)于噬菌體治療的抗性問題爭論中暗示，盡管噬菌體治療廣泛使用，但對病原菌細(xì)菌而言，不能再發(fā)現(xiàn)具有感染能力的新噬菌體的情況是不太可能出現(xiàn)。從歷史的角度看，噬菌體治療已經(jīng)失敗了一次［30]，我們再次嘗試的時候需要小心謹(jǐn)慎。最近Denomy 等［31]研究發(fā)現(xiàn)感染綠膿假單胞菌噬菌體編碼的抗CRISPR基因可能是噬菌體克服高度普遍的CRISPR/Cas（規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)系統(tǒng)）系統(tǒng)的機(jī)制，抗CRISPR基因的存在為闡明CRISPR/Cas功能性機(jī)制提供了新的方向，并為理解噬菌體和細(xì)菌的共進(jìn)化提供了新的觀點。Seed等［32]研究發(fā)現(xiàn)霍亂菌（Cholera bacteria）的一種噬菌體能“偷走”細(xì)菌的功能免疫系統(tǒng)，并利用它關(guān)閉霍亂菌對抗噬菌體的防御體系，從而殺死霍亂菌，繁殖更多的噬菌體后代，這樣又能殺死更多的霍亂菌。他們的研究［32]首次證明了這種病毒：噬菌體能夠獲得完全功能性的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，這項研究對于噬菌體療法而言具有重要的意義。

因此，在新的“傳統(tǒng)”抗生素發(fā)展和開發(fā)已經(jīng)變得更難的時候，為了充分利用噬菌體治療的優(yōu)勢，克服噬菌體治療的難點，使噬菌體制劑治療更具安全性和可控性，在噬菌體的生物特性、噬菌體-細(xì)菌的協(xié)同進(jìn)化、噬菌體-細(xì)菌-宿主三者之間的相互作用關(guān)系等方面需要做更多的研究。

［1] Andersson DI, Hughes D. Evolution of antibiotic resistance at nonlethal drug concentrations［J] . Drug Resist Update, 2012（15）：162-172.

［2] Bennett PM. Plasmid encoded antibiotic resistance：acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria［J] . Br J Pharmacol, 2008, 153（S1）：S347-357.

［3] Jalasvuori M, Friman VP, Nieminen A, et al. Bacteriophage selection against a plasmid-encoded sex apparatus leads to the loss of antibiotic-resistance plasmids［J] . Biol Lett, 2011（7）：902-905.

［4] Dahlberg C, Chao L. Amelioration of the cost of conjugative plasmid carriage inEschericha coliK12［J] . Genetics, 2003（165）：1641-1649.

［5] 趙慶友, 朱瑞良. 噬菌體制劑的研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景［J] .中國獸藥雜志, 2010, 44（7）：40-43.

［6] 胡重怡, 蔡劉體. 噬菌體治療作物細(xì)菌性病害的研究進(jìn)展［J] .貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39（3）：101-103.

［7] Guenther S, Huwyler D, Richard S, et al. Virulent bacteriophage for efficient biocontrol ofListeria monocytogenesin ready-to-eat foods［J] .Appl Environ Microbiol, 2009, 75（1）：93-100.

［8] US. Food and Drug Administration, 2007. Agency response letter GRAS notice No. GRN 000218, viewed 11/09/2007［EB/OL] .http：//www.cfsan.fda.gov/~rdb/opa-g218.html.

［9] 陳燦煌, 趙霞. 細(xì)菌對噬菌體的抵抗機(jī)制研究進(jìn)展［J] . 重慶醫(yī)學(xué), 2013, 42（6）：697-700.

［10] 李鐵民, 杜波. CRISPR-Cas 系統(tǒng)與細(xì)菌和噬菌體的共進(jìn)化［J] .遺傳, 2011, 33（3）：213-218.

［11] Hyman P, Abedon ST. Bacteriophage host range and bacterial resistance［J] . Adv Appl Microbiol, 2010（70）：217-248.

［12] Gu J, Liu X, Li Y, et al. A method for generation phage cocktail with great therapeutic potential［J] . PLoS One, 2012（7）：e31698.

［13] Chan BK, Abedon ST. Phage therapy pharmacology phage cocktails［J] . Adv Appl Microbiol, 2012（78）：1-23.

［14] Bush K, Courvalin P, Dantas G, et al. Tackling antibiotic resistance［J] . Nat Rev Microbiol, 2011（9）：894-906.

［15] Krylov V, Shaburova O, Krylov S, Pleteneva E. A genetic approach to the development of new therapeutic phages to fight pseudomonas aeruginosa in wound infections［J] . Viruses, 2013（5）：15-53.

［16] Clokie MR, Millard AD, Letarov AV, Heaphy S. Phages in nature［J] . Bacteriophage, 2011（1）：31-45.

［17] Sechter I, Mestre F, Hansen DS. Twenty-three years of Klebsiella phage typing：a review of phage typing of 12 clusters of nosocomial infections, and a comparison of phage typing with K serotyping ［J] .Clin Microbiol Infect, 2000（6）：233-238.

［18] Dennehy JJ. What can phages tell us about host-pathogen Coevolution? ［J] . Int J Evol Biol, 2012（2012）：1-13.

［19] Marston MF, Pierciey FJ Jr, Shepard A, et al. Rapid diversification of coevolving marineSynechococcusand a virus［J] . Proc Natl Acad Sci USA, 2012（109）：4544-4549.

［20] Capparelli R, Nocerino N, Iannaccone M, et al. Bacteriophage therapy ofSalmonella enterica：a fresh appraisal of bacteriophage therapy［J] . J Infect Dis, 2010（201）：52-61.

［21] Orm?l? AM, Jalasvuori M. Phage therapy：should bacterial resistance to phages be a concern, even in the long run? ［J] .Bacteriophage, 2013, 3（1）：e24219.

［22] Gómez P, Buckling A. Bacteria-phage antagonistic coevolution in soil［J] . Science, 2011（332）：106-109.

［23] Meyer JR, Agrawal AA, Quick RT, et al. Parallel changes in host resistance to viral infection during 45, 000 generations of relaxed selection［J] . Evolution, 2010（64）：3024-3034.

［24] Inal JM. Phage therapy：a reappraisal of bacteriophages as antibiotics［J] . Arch Immunol Ther Exp（Warsz）, 2003（51）：237-244.

［25] Capparelli R, Nocerino N, Lanzetta R, et al. Bacteriophage resistantStaphylococcus aureusmutant confers broad immunity against staphylococcal infection in mice ［J] . PLoS One, 2010（5）：e11720.

［26] Filippov AA, Sergueev KV, He Y, et al. Bacteriophage-resistant mutants inYersinia pestis：identification of phage receptors and attenuation for mice［J] . PLoS One, 2011（6）：e25486.

［27] Wei Y, Ocampo P, Levin BR. An experimental study of the population and evolutionary dynamics ofVibrio choleraeO1 and the bacteriophage JSF4［J] . Proc Biol Sci, 2010（277）：3247-3254.

［28] Flores CO, Meyer JR, Valverde S, et al. Statistical structure of hostphage interactions［J] . Proc Natl Acad Sci USA, 2011（108）：E288-297.

［29] Wolf A, Wiese J, Jost G, Witzel KP. Wide geographic distribution of bacteriophages that lyse the same indigenous freshwater isolate（Sphingomonassp. strain B18）［J] . Appl Environ Microbiol,2003（69）：2395-2398.

［30] Sulakvelidze A, Alavidze Z, Morris JG Jr. Bacteriophage therapy［J] . Antimicrob Agents Chemother, 2001（45）：649-659.

［31] Denomy JB, Pawluk A, Maxwell KL, Davidson AR. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system［J] . Nature, 2013（493）：429-432.

［32] Seed KD, Lazinski DW, Calderwood SB, Camilli A. A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity［J] . Nature, 2013（494）：489-491.