孫煒寧，張巧格，李興興，韓燁

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

葡萄酒釀造過程中微生物多樣性的研究現(xiàn)狀

孫煒寧，張巧格，李興興，韓燁*

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

葡萄酒是由新鮮葡萄漿果或葡萄汁發(fā)酵而成的酒精飲料。葡萄酒的釀造過程本質(zhì)上是包括酵母、細(xì)菌、絲狀真菌在內(nèi)的多種微生物復(fù)雜作用的過程。本文主要闡述了從葡萄收集直到葡萄酒后發(fā)酵過程中，微生物的種類及數(shù)量的變化情況及葡萄酒釀造中微生物之間的相互作用對微生物多樣性的影響。

葡萄酒；微生物多樣性；微生物相互作用

葡萄酒釀制過程的本質(zhì)是從葡萄收集、葡萄破碎成汁、葡萄酒一次、二次發(fā)酵直到包裝、儲藏整個釀造過程中多種微生物的代謝過程。葡萄汁發(fā)酵物及葡萄酒中的環(huán)境是低pH及高酒精濃度的，只有耐酸耐酒精的微生物可以生長。在釀酒過程中最重要的菌株為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae及酒酒球菌Oeno－coccus oeni分別進(jìn)行酒精發(fā)酵及蘋果酸—乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF），其他菌株在葡萄及葡萄酒中生長的微生物對酒的品質(zhì)有顯著的影響。

1 葡萄酒的簡要釀制過程

葡萄酒的釀造始于收集和破碎葡萄。白葡萄酒通過冷沉淀、澄清過濾或離心分離葡萄汁與葡萄皮，然后將葡萄汁移至木桶中。酒精發(fā)酵是由果汁中的自帶酵母或通過接種釀酒酵母發(fā)酵完成。將葡萄汁中主要的葡萄糖及果糖消耗后，酒被認(rèn)為是“干葡萄酒”，將酒液與酵母及葡萄的殘渣分離。

紅葡萄酒的生產(chǎn)與白葡萄酒的生產(chǎn)略有不同。葡萄經(jīng)破碎后葡萄皮浸泡在發(fā)酵液中提取顏色。紅葡萄酒通過自帶酵母或接種發(fā)酵劑進(jìn)行酒精發(fā)酵。在葡萄發(fā)酵中葡萄皮會漂浮到頂部形成一個“帽子”。為了更好地提取紅顏色和豐富葡萄酒風(fēng)味，釀酒師采取穿孔或從底部泵汁的辦法去除“帽子”的影響。一段時間后，葡萄酒與葡萄皮分離，葡萄汁在另一個容器中進(jìn)行發(fā)酵直至完成。酒精發(fā)酵完成后，根據(jù)葡萄酒的情況通過自帶或接種乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）自發(fā)或有目的進(jìn)行MLF，將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸。待發(fā)酵結(jié)束后要對葡萄酒中殘留的微生物進(jìn)行處理，防止酒的腐敗[1]。

2 不同釀酒時期微生物的多樣性

2.1 葡萄園中與釀酒相關(guān)的微生物

葡萄中一半的酵母來自葡萄園如尖頂型的無性生殖的酵母，漢森氏酵母屬Hanseniaspora和克勒克酵母屬Kloeckera。葡萄園中還存在一些對釀酒有作用的酵母擲孢酵母屬Sporobolomyces、克魯維酵母屬Kluyveromyces[2]。

2.2 葡萄表面及漿果中的微生物

葡萄中的微生物的類型會影響隨后發(fā)酵過程中的生態(tài)環(huán)境尤其是在發(fā)酵初期的環(huán)境。漿果中微生物的數(shù)量水平大致在107CFU/g～108CFU/g，其中酵母的數(shù)量在105CFU/g～106CFU/g。漿果中的酵母種類有梅奇酵母屬Metschnikowia、假絲酵母屬Candida、隱球酵母屬Cryptococcus、紅酵母屬Rhodotorula、畢赤氏酵母屬Pichia、接合酵母屬Zygosaccharomyces、球擬酵母屬Torulopsis，占主導(dǎo)地位的是梅奇酵母屬及漢森酵母屬。破損的葡萄中漢森酵母屬Hanseniaspora、假絲酵母屬Candida、梅奇酵母屬Metschnikowia數(shù)量顯著增加。釀酒酵母saccharomyces cerevisiae在葡萄中很少見，數(shù)量少于10CFU/g～100CFU/g[3-6].

同時發(fā)現(xiàn)有醋酸菌（葡糖桿菌屬、醋酸桿菌屬）、LAB在葡萄微生物群中占據(jù)一小部分。

絲狀真菌聚集在葡萄的表面，可以侵染葡萄（葡萄孢屬Botrytis、鏈格孢屬Alternaria、單軸霉屬Plasmopara、曲霉屬Aspergillus）；其中較常見的有短梗茁霉AureobasidiuMpullulans及灰霉菌Botrytis cinerea。生長在葡萄上的霉菌產(chǎn)生多種代謝物如真菌毒素赭曲霉素A并且干擾葡萄的微生物生態(tài)環(huán)境并從而影響酒精發(fā)酵中酵母的生長，改變酒的風(fēng)味。葡萄孢屬會影響糖類、酒石酸、蘋果酸的代謝，減少總糖量，提高葡萄酒的pH?；颐咕稍斐苫颐共?，其它的霉菌可以參與由其它微生物引發(fā)的感染，但自己不足以引起感染[7-8]。此外，真菌在葡萄表面會創(chuàng)造一種利于醋酸菌生長的環(huán)境，醋酸菌數(shù)量的增多易造成酒的腐敗。

2.3 葡萄汁及葡萄酒中的微生物

2.3.1 葡萄汁及葡萄酒中的細(xì)菌

新鮮無破損的葡萄制成的葡萄汁中只有少量的細(xì)菌（＜103CFU/mL～104CFU/mL），當(dāng)酵母啟動酒精發(fā)酵后，細(xì)菌生長停滯并逐漸死亡。根據(jù)葡萄汁及葡萄酒的酸度、營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、酒精濃度，其中生長活躍的細(xì)菌通常包括LAB及醋酸菌。其他的細(xì)菌如梭狀芽胞桿菌clostridia、放線菌actinomyces、鏈霉菌屬streptomyces也存在于酒的環(huán)境中，但比較少見。被土壤污染的葡萄中存在梭狀芽胞桿菌，它產(chǎn)生的孢子對熱和化學(xué)處理有很強(qiáng)的抵抗力，因此處理被它污染的酒液比較棘手。鏈霉菌屬可降解纖維造成對過濾裝置的破壞。大多數(shù)與酒相關(guān)的細(xì)菌及很多酵母對SO2敏感[9]。

LAB是兼性厭氧菌，在厭氧的環(huán)境中可存活；參與釀酒的LAB主要來自4個屬（乳桿菌屬Lactobacillus、片球菌屬Pediococcus、明串珠菌屬Leuconostoc、酒球菌屬Oenococcus[10]）。這些微生物普遍存在于葡萄及釀酒環(huán)境中。葡萄的破碎成數(shù)量級的增加了乳酸菌的數(shù)量；酒精發(fā)酵的第一周釀酒酵母產(chǎn)生的酒精減少LAB的數(shù)量，通常低于103CFU每mL；酒的pH強(qiáng)烈的影響LAB的存活，在發(fā)酵中及發(fā)酵后pH高于3.5對乳桿菌屬及片球菌屬的存活有利，當(dāng)pH低于3.5對酒球菌屬存活有利[11]。新發(fā)酵的葡萄酒中LAB的數(shù)量較低，主要是由于pH、酒精、抑菌物質(zhì)如SO2等因素的影響。當(dāng)酒進(jìn)入貯藏階段，LAB對酒精的耐受力增加。LAB的數(shù)量又有所增長[12]。

在一些葡萄酒中會發(fā)生MLF，它是一種重要的二次發(fā)酵，在酒精完全發(fā)酵后的兩到三周內(nèi)進(jìn)行[13]。酒球菌O.oeni主導(dǎo)MLF通過將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為L-乳酸從而降低酒的酸度、產(chǎn)生其他代謝物增進(jìn)酒的風(fēng)味、消耗多余的養(yǎng)分提高酒中微生物的穩(wěn)定性，對葡萄酒的釀造具有重要的影響[14]。

醋酸菌是革蘭氏陰性需氧菌，可利用甘油和酒精產(chǎn)生醋酸、乙醛、乙酸乙酯。葡萄酒中的醋酸菌主要來自3個屬，醋桿菌屬Acetobacter、葡糖桿菌屬Gluconobacter、葡糖醋桿菌屬Gluconacetobacter[15]。破碎的葡萄中含有相當(dāng)數(shù)量的葡糖桿菌屬，其產(chǎn)生的葡萄糖酸及其它含羰基化合物可以與SO2結(jié)合，降低亞硫酸鹽的抑制作用，導(dǎo)致葡萄汁的腐敗。一旦進(jìn)行葡萄汁發(fā)酵，厭氧環(huán)境有效抑制醋酸菌的生長和新陳代謝。但有很多醋酸菌在厭氧發(fā)酵結(jié)束后仍存在，并未完全消除在發(fā)酵過程中[16]。事實上，醋酸菌在木桶頂部存在空氣的環(huán)境中可存活，直到活躍發(fā)酵期木桶頂部被CO2充滿。發(fā)酵過程中泵送酒液到頂部有效減輕醋酸菌對葡萄酒的毒害作用。

2.3.2 葡萄汁及普通酒中的酵母

葡萄汁及葡萄酒微生物中酵母占據(jù)主導(dǎo)地位。葡萄汁及葡萄酒中還包含大量的酵母如梅奇酵母屬Metschnikowia、酒香酵母屬Brettanomyces、畢赤氏酵母屬Pichia、假絲酵母屬Candida、漢森氏酵母屬Hanseniaspora、克魯維酵母屬Kluyveromyces、孢圓酵母屬Torulaspora、德巴利氏酵母屬Debaryomyces、接合酵母屬Zygosaccharomyce、裂殖酵母屬Schizosaccharomyces[17]。其中的漢森氏酵母、假絲酵母、梅奇酵母啟動酒精的發(fā)酵。畢赤氏酵母屬、伊薩酵母屬Issatchenkia、克魯維酵母屬在這一階段進(jìn)一步增長。這些酵母的濃度會達(dá)到106CFU/mL～107CFU/mL。這些酵母在發(fā)酵中期逐漸減少[18-19]。釀酒酵母對其代謝產(chǎn)物尤其是酒精的高耐受力使它成為發(fā)酵中期及后期的優(yōu)勢菌種，濃度達(dá)到107CFU/mL～108CFU/mL。漢森氏酵母屬、假絲酵母屬、梅奇酵母屬、伊薩酵母屬、克魯維酵母屬對濃度超過5%～7%的酒精沒有耐受力，在發(fā)酵中期逐漸減少。這些菌株在低溫時對酒精的敏感度降低，當(dāng)溫度低于15℃～20℃，假絲酵母及漢森氏酵母發(fā)酵一部分酒精。與釀酒酵母一樣在發(fā)酵后期成為優(yōu)勢菌株[20]。

2.4 葡萄汁及葡萄酒中微生物多樣性的影響因素

2.4.1 環(huán)境因素

很多環(huán)境因素影響葡萄酒中的微生物菌群。其中pH的影響最大，低pH（＜3.5）抑制很多細(xì)菌，尤其是乳酸菌不能生長。在葡萄酒正常pH范圍內(nèi)（2.8～4.2）酵母的生長不受影響。

溫度是另一個重要的因素，低溫抑制細(xì)菌、釀酒酵母的生長，當(dāng)溫度低于12℃釀酒酵母的初發(fā)酵被抑制。長期低溫并添加適量營養(yǎng)物質(zhì)有利于葡萄汁中野生微生物的生長[21]。

在釀酒酵母大量繁殖之前，醋酸菌、霉菌為需氧菌，有氧氣的環(huán)境易導(dǎo)致腐敗發(fā)生。釀酒酵母對氧氣的競爭能力很強(qiáng)，當(dāng)釀酒酵母開始大量繁殖時需適當(dāng)通風(fēng)促進(jìn)釀酒酵母的繁殖。LAB是兼性厭氧菌，氧氣促進(jìn)釀酒酵母生長的同時也對兼性厭氧的LAB的生長有刺激作用。

2.4.2 釀酒操作

釀酒中的操作對葡萄酒中的微生物菌群都會產(chǎn)生影響，如SO2的使用，冷浸、發(fā)酵溫度、通風(fēng)、添加營養(yǎng)物質(zhì)、接種釀酒酵母[22]。衛(wèi)生狀況如設(shè)備清潔的頻率。其他操作如浸皮、帽處理、浸泡時間都會影響微生物的生長；漿果中的微生物像膜一樣附著在漿果表面難以去除，但營養(yǎng)豐富的葡萄汁環(huán)境類似于發(fā)酵培養(yǎng)基，由分裂產(chǎn)生的新細(xì)胞會釋放到發(fā)酵物中。因此，果皮接觸葡萄汁時間的長短影響后代細(xì)胞的釋放，從而影響葡萄汁中微生物的種類；帽處理中泵數(shù)量及種類的選取也會影響葡萄汁中微生物的種類。酒精發(fā)酵過程對酒液表面微生物的抑制作用取決于厭氧條件下木桶上方CO2層的形成。如果要豐富葡萄酒中微生物區(qū)系，就推遲釀酒酵母的接種，為其他微生物的生長及終產(chǎn)物的產(chǎn)生提供充足的時間。提前添加營養(yǎng)物質(zhì)會促進(jìn)非釀酒酵母的繁殖。

2.4.3 微生物的相互作用

葡萄酒中微生物的相互作用包括競爭有限的營養(yǎng)成分和通過代謝產(chǎn)生最終產(chǎn)物抑制其他菌種生長的物質(zhì)。酵母的代謝產(chǎn)物如酒精可以抑制大多數(shù)的細(xì)菌、霉菌及一些酵母。當(dāng)酒精濃度大于7%，非釀酒酵母的生長受到抑制。一些釀酒酵母會產(chǎn)生抑制肽抑制其他酵母菌株。釀酒在缺氧的環(huán)境中競爭氧氣的能力更強(qiáng)，非釀酒酵母對于缺氧的環(huán)境缺乏耐受力，移除多余的氧氣使非釀酒酵母更早地死亡。非釀酒酵母在發(fā)酵初期可以利用氨基酸及維他命來生長，從而限制了釀酒酵母的生長。在發(fā)酵的中后期，死亡及自身溶解的非釀酒酵母的細(xì)胞可成為釀酒酵母的營養(yǎng)源[23]。細(xì)菌同樣可以產(chǎn)生細(xì)菌素抑制其他細(xì)菌的生長。酒精發(fā)酵結(jié)束后，自溶的酵母為隨后引發(fā)MLF的酒酒球菌提供了營養(yǎng)，刺激了酒酒球菌的生長。在活躍發(fā)酵期，霉菌幾乎不存在。但霉菌產(chǎn)生的霉菌毒素會殘留在漿果表面抑制葡萄汁及葡萄酒中的微生物。葡萄鉤絲殼菌Uncinula necator污染葡萄產(chǎn)生的蘑菇味在酒精發(fā)酵中可消除；酵母細(xì)胞壁中尤其是β-葡聚糖對霉菌毒素有吸附的作用[24]。

3 瓶裝酒中微生物的控制

已經(jīng)裝瓶的葡萄酒中要防止瓶中微生物的生長代謝從而防止葡萄酒變渾濁、失去風(fēng)味。腐敗微生物包括細(xì)菌、酵母、霉菌；細(xì)菌包括乳酸菌、醋酸菌、芽孢桿菌、鏈霉菌。

3.1 細(xì)菌造成腐敗

LAB（短乳桿菌Lactobacillusbrevis、腸系膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides）會降解賴氨酸造成酒液顏色變深，利用組氨酸等氨基酸產(chǎn)生組胺使部分消費者產(chǎn)生頭痛；幾種菌共同發(fā)酵葡萄酒中的糖，產(chǎn)生乳酸、CO2、醋酸、甘油等，使酒具有酸白菜和酸牛奶味，破壞酒的品質(zhì)。醋桿菌屬侵染葡萄酒后會在酒液與空氣接觸的表面形成一層淡灰色的薄膜，最初是透明的，以后變暗，有時形成帶褶皺的玫瑰色薄膜，然后薄膜部分脫落沉人酒液中造成酒體渾濁，發(fā)出不良醋酸氣味，使酒液的揮發(fā)酸含量增高[25]。

苦味芽孢桿菌侵染葡萄酒使之變苦，多發(fā)生在紅葡萄酒和老酒中。受侵染的葡萄酒中還原糖、酒石酸鹽類和甘油含量都減少，總酸、揮發(fā)酸含量增加。

3.2 霉菌造成腐敗

來自腐敗的軟木塞中的霉菌，會引起酒的渾濁；代謝產(chǎn)生的2，4，6-三氯苯甲醚使酒液中出現(xiàn)的霉塞味。

3.3 酵母造成腐敗

接合酵母對糖有很高的耐受力會產(chǎn)生CO2造成酒的渾濁。畢赤氏酵母也造成酒的渾濁。假絲酵母在酒表面形成一層灰白色或暗黃色的，隨時間增厚，并逐漸將酒液覆蓋；進(jìn)而膜破裂，白色碎片下沉并且產(chǎn)生酒精或乙醛。酒香酵母降解賴氨酸，產(chǎn)生纖維素酶將木桶中的纖維素降解為多糖并利用。釀酒酵母在糖分含量高的酒中易造成二次發(fā)酵，在瓶中會使酒渾濁、產(chǎn)生CO2[26]。

4 結(jié)論

葡萄及周圍環(huán)境中的微生物具有多樣性，葡萄酒的釀造是不同種屬的LAB、酵母及真菌共同作用的結(jié)果，葡萄汁發(fā)酵是由酵母菌群相互作用引起的，酵母菌群與細(xì)菌及絲狀真菌的相互作用對葡萄酒的品質(zhì)也有顯著的影響。對不同種屬間微生物的生理、化學(xué)水平及生物化學(xué)方面的相互作用需要進(jìn)一步了解。

[1]Milanowski T.Solar Energy in the Winemaking Industry[M]. Springer,2011

[2]Nisiotou A A,NychasG JE.Yeastpopulations residingon healthy or Botrytis-infected grapes froMa vineyard in Attica,Greece[J].Applied and environmentalmicrobiology,2007,73(8)：2765-2768

[3]Renouf V,Claisse O,Lonvaud A.Understanding the microbial ecosysteMon thegrape berry surface through numeration and identification of yeast and bacteria[J].Australian Journal of Grape and WineResearch,2005,11(3)：316-327

[4]Mortimer R,PolsinelliM.On theoriginsofwine yeast[J].Research in microbiology,1999,150(3)：199-204.

[5]Martini A,CianiM,ScorzettiG.Direct enumeration and isolation of wine yeasts froMgrape surfaces[J].American Journalof Enology and Viticulture,1996,47(4)：435-440

[6]FleetGH.Themicrobiology ofalcoholic beverages[M].Springer US, 1997：217-262

[7]Stander MA,Steyn P S.Survey of ochratoxin A in South African wines[J].S.Afr.J.Enol.Vitic,2002,23(1)：9-13

[8]Stummer B E,Francis IL,Markides A J,et al.The effectof powdery mildew infection ofgrape berrieson juice and wine composition and on sensory properties of Chardonnay wines[J].Australian Journalof grapeandwine research,2003,9(1)：28-39

[9]SponholzW R.Wine spoilage bymicroorganisms[J].Winemicrobiology and biotechnology,1993：395-420

[10]Lonvaud-Funel A.Lactic acid bacteria in the quality improvement and depreciation ofwine[M].Springer Netherlands,1999：317-331

[11]Davis CR,Wibowo D,FleetGH,etal.Properties ofwine lactic acid bacteria：their potential enological significance[J].American Journalof Enology and Viticulture,1988,39(2)：137-142.

[12]Osborne JP,EdwardsCG.Bacteria importantduringwinemaking[J]. Advances in food and nutrition research,2005,50：140

[13]Lonvaud-Funel A.Lactic acid bacteria in the quality improvement and depreciation ofwine[M],1999：317-331

[14]FleetGH.Yeastinteractionsand wine flavour[J].International journalof foodmicrobiology,2003,86(1)：11-22

[15]Ruiz A,PobletM,Mas A,et al.Identification of acetic acid bacteria by RFLP of PCR-amplified 16S rDNA and 16S-23S rDNA intergenic spacer[J].International Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology,2000,50(6)：1981-1987

[16]Du ToitW J,LambrechtsMG.The enumeration and identification of acetic acid bacteria froMSouth African red wine fermentations[J]. International journalof foodmicrobiology,2002,74(1)：57-64

[17]Loureiro V,Malfeito-FerreiraM.Spoilage yeasts in thewine industry [J].International journalof foodmicrobiology,2003,86(1)：23-50

[18]CianiM,Comitini F,Mannazzu I,et al.Controlledmixed culture fermentation：a new perspective on the use of non-Saccharomyces yeasts inwinemaking[J].FEMSyeast research,2010,10(2)：123-133

[19]Bisson LF.Stuck and sluggish fermentations[J].American Journalof Enology and Viticulture,1999,50(1)：107-119

[20]Erten H.Relationsbetween elevated temperaturesand fermentation behaviour of Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associatedwithwinemaking inmixed cultures[J].World JournalofMicrobiology and Biotechnology,2002,18(4)：377-382

[21]Du ToitW J,Pretorius IS.The occurrence,controland esoteric effect of acetic acid bacteria in winemaking[J].Annals of Microbiology, 2002,52(2)：155-179

[22]Stratford M,Morgan P,Rose A H.Sulphur dioxide resistance in Saccharomyces cerevisiae and Saccharomycodes ludwigii[J].Journal of generalmicrobiology,1987,133(8)：2173-2179

[23]Dizy M,Bisson L F.Proteolytic activity of yeast strains during grape juice fermentation[J].American journal of enology and viticulture, 2000,51(2)：155-167

[24]Lyons T P.Natural products and programs 2002：navigating froMnichemarkets tomainstream[J].Nutritional Biotechnology in the Feed and Food Industries,NottinghaMUniversity Press,Nottingham, 2002,20(11)：1-12

[25]SponholzW R.Wine spoilage bymicroorganisms[J].Winemicrobiology and biotechnology,1993,15(12)：395-420

[26]Pretorius IS,Bauer F F.Meeting the consumer challenge through genetically customized wine-yeaststrains[J].Trends in biotechnology,2002,20(10)：426-432

Progress on Microbial Diversity Study in W ine Production

SUNWei-ning，ZHANGQiao-ge，LIXing-xing，HANYe*
（SchoolofChemicalEngineeringand Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

The nature ofwinemaking process is the process of complex interactions between yeast、bacteria、filamentous fungi.Thisarticle describes the changesof speciesand quantitiesofmicrobes froMthe collection of grapesuntilwinepostfermentationand the interactionsbtweenmicrobesimpacton themicrobialdiversity.

wine；microbialdiversity；microbial interaction

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.098

2014-09-24

孫煒寧（1992—），女（漢），大學(xué)本科，研究方向：葡萄酒微生物多樣性。

*通信作者