一種從大腸桿菌包涵體中分離純化GST-TRAF6融合蛋白的方法

張西軒 李曄 張振奇 董世瑞 趙培 阮海華

（天津商業(yè)大學(xué) 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

一種從大腸桿菌包涵體中分離純化GST-TRAF6融合蛋白的方法

張西軒 李曄 張振奇 董世瑞 趙培 阮海華

（天津商業(yè)大學(xué) 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

利用8 mol/L尿素溶液對表達(dá)在大腸桿菌包涵體中的GST-TRAF6融合蛋白進(jìn)行變性，通過逐級稀釋復(fù)性的方法對尿素溶解后的GST-TRAF6融合蛋白進(jìn)行復(fù)性，將復(fù)性后的GST-TRAF6融合蛋白進(jìn)一步利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂親和層析的方法進(jìn)行分離純化，將分離純化后的蛋白通過Western blot方法進(jìn)行驗證，最后利用體外泛素化反應(yīng)檢測經(jīng)包涵體變性、復(fù)性和純化后的GST-TRAF6融合蛋白的生物學(xué)活性。經(jīng)過包涵體變性、梯度稀釋復(fù)性和谷胱甘肽瓊脂糖樹脂親和層析3個步驟后純化得到純度達(dá)90%以上、濃度為396 ng/μL的蛋白質(zhì)溶液。利用GST蛋白作為對照，經(jīng)Western blot驗證表明，純化得到的蛋白確為GSTTRAF6融合蛋白。進(jìn)一步利用體外泛素化反應(yīng)分析其泛素連接酶活性發(fā)現(xiàn)，17 ng/μL濃度的GST-TRAF6融合蛋白能夠以泛素分子作為底物在5 min內(nèi)快速催化自由泛素鏈的生成。結(jié)果表明，表達(dá)在大腸桿菌包涵體中的GST-TRAF6融合蛋白經(jīng)尿素變性溶解后能夠成功復(fù)性并分離純化，在溶解性改變的同時恢復(fù)了其泛素連接酶活性。為從大腸桿菌包涵體中大規(guī)模分離純化蛋白質(zhì)提供了一種新的復(fù)性方法。

TRAF6 蛋白純化 包涵體復(fù)性 重組蛋白

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（Tumornecrosis factor receptor-associated factors，TRAFs）是腫瘤壞死因子（Tumornecrosis factor，TNF）超家族和 Toll 樣/白細(xì)胞介素-1受體（toll/IL-1 receptor，TIR）超家族重要的接頭分子，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用［1，2］。TRAFs 包括7個密切相關(guān)的蛋白（TRAF1-7），其中TRAF6 是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、TIR 和 TNF（Tumor necrosis factor）等刺激信號的下游分子［3-5］。TRAF6含有C端TRAF結(jié)構(gòu)域和 N 端激活結(jié)構(gòu)域，可以和多種激酶結(jié)合［6］。其中，其N端激活結(jié)構(gòu)域包括一個 RING 型泛素連接酶（ubiquitin ligase enzyme，E3）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有泛素連接酶活性，可在泛素結(jié)合酶（ubiquitinconjugating enzyme，E2）UbcH5c 的介導(dǎo)下催化自由泛素分子形成多聚泛素鏈［7，8］。研究表明，TRAF6與炎癥、骨代謝、乳腺發(fā)育、淋巴結(jié)的形成密切相關(guān)，參與免疫性疾病、骨髓瘤、急性胰腺炎、前列腺癌等疾病的病理機制，在細(xì)胞的生長、發(fā)育以及疾病過程中發(fā)揮重要的作用［9］。孫利等［10］在大腸桿菌中誘導(dǎo)了GST-TRAF6融合蛋白的表達(dá)，并利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂純化到了該融合蛋白。但是，大腸桿菌中表達(dá)的GST-TRAF6融合蛋白只有少部分重組蛋白是可溶的，大部分的重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)過程中主要以包涵體的形式存在。較低的蛋白可溶性降低了GST-TRAF6融合蛋白的純化效率以及重組蛋白的純化總量，因此，在孫利等［10］的研究成果基礎(chǔ)上，本研究運用了一種從包涵體中復(fù)性并分離純化GST-TRAF6融合蛋白的方法，以期獲得更高產(chǎn)量更高純度的GST-TRAF6融合蛋白，降低純化成本，并為今后進(jìn)一步研究 TRAF6 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能打下堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自美國Promega公司；pGEX-6P-2原核表達(dá)載體購自GE Healthcare 公司。

1.1.2 酶與試劑 辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)羊抗小鼠二抗、辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)羊抗兔二抗、γ-ATP 購自美國Promega公司；兔源TRAF6 抗體（α-TRAF6 Cat：sc-7221）、鼠源泛素抗體（α-Ub，Cat：sc-8017）購自美國 Santa Cruz公司；HeLa細(xì)胞 cDNA文庫（Cat：YJ0001）購自上海英基生物科技有限公司；瓊脂糖、尿素、DTT、Triton X-100、IPTG、PMSF購自美國Amresco公司；BglⅡ、BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PfuDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker購自日本TaKaRa公司；PCR及酶切產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒 DNA 提取試劑盒購自中國北京天根公司；預(yù)染蛋白Marker購自美國 Thermo 公司；超濾濃縮管、泛素激活酶E1（Cat：14-857）、UbcH5c（Cat：23-035）、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司；X光片購自美國Kodak公司；Ubiquitin蛋白由西南大學(xué)李洪濤教授提供；引物合成以及測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 TRAF6基因的克隆與原核表達(dá)載體的構(gòu)建以HeLa細(xì)胞cDNA文庫為模板，上游引物序列為5'-CGAGATCTATGAGTCTGCTAAACTGTGAAAAC-3'（下劃線為BglⅡ酶切位點），下游引物序列為5'-GCCTCGAGCTATACCCCTGCATCAGTAC-3'（下劃線為XhoⅠ酶切位點），以58℃作為退火溫度進(jìn)行 PCR擴增，將 PCR 產(chǎn)物回收后分別用BglⅡ和XhoⅠ雙酶切并回收產(chǎn)物。同時利用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pGEX-6p-2空載體，回收并將其與酶切后的TRAF6片段進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上挑取單克隆并抽提質(zhì)粒。其中，由于TRAF6基因片段上第31-36位堿基間為BamHⅠ位點，因此在設(shè)計TRAF6上游引物時選擇了BamHⅠ的同尾酶BglⅡ作為酶切位點，而對候選陽性重組質(zhì)粒的酶切鑒定采用BamHⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點，將陽性pGEX-6P-2-TRAF6重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行 DNA 測序。測序正確的陽性克隆用于之后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.2 TRAF6在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將 pGEX-6P-2-TRAF6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），挑取單克隆至5 mL LB（含 100 μg/mL氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中，并于37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物接入 1 L LB（含100 μg/mL氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中，并于37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8之間。將培養(yǎng)物降溫至20℃左右后加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，20℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；收集菌液，室溫下8 000 r/min 離心30 min；棄上清，保留沉淀；取10 μL離心后菌體用90 μL無菌水重懸，加入100 μL 2×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸5-10 min 后離心，進(jìn)行 SDS-PAGE，觀察全菌蛋白的表達(dá)情況；以未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌為陰性對照。

1.2.3 包涵體蛋白的變性、復(fù)性與純化 將上述收集的菌體利用50 mmol/L Tris-HCl pH8.0 內(nèi)含 150 mmol/L NaCl、1 mmol/L PMSF 的緩沖溶液于冰上進(jìn)行超聲破碎，超聲3 s、間隔7 s，超聲約100次至懸液半透明；于14 000 r/min轉(zhuǎn)速下低溫離心30 min，將離心后的上清棄掉，用破碎緩沖重懸沉淀并將懸液再次于14 000 r/min轉(zhuǎn)速下低溫離心30 min，沉淀即為包涵體部分。為了去除包涵體中的部分雜蛋白，首先對包涵體進(jìn)行洗滌，洗滌液的組成為50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，內(nèi)含 2 mol/L尿素、1 mmol/L EDTA、0.5% Triton X-100、0.1 mol/L NaCl 以及10 mmol/L DTT，14 000 r/min 轉(zhuǎn)速下低溫離心10 min，離心后收集沉淀。將洗滌后的包涵體利用變性液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，含 8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT）進(jìn)行變性溶解；將溶解后的包涵體溶液利用復(fù)性液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，含0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaCl、5% glycerol、1 mmol/L DTT）按照2倍的梯度進(jìn)行稀釋復(fù)性，直至稀釋到尿素終濃度達(dá)到0.5 mol/L；最后利用截留分子量為3 kD的超濾濃縮管濃縮復(fù)性后的溶液。濃縮后的復(fù)性溶液與適量的谷胱甘肽瓊脂糖樹脂勻漿混合，4℃輕搖30 min；于500 r/min 離心5 min后棄上清；沉淀加入10倍柱床體積的漂洗液，即50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液反復(fù)顛倒混勻以洗去未與谷胱甘肽瓊脂糖樹脂結(jié)合的雜蛋白，4℃、500 r/min離心5 min 后棄上清，繼續(xù)用漂洗液重復(fù)洗滌谷胱甘肽瓊脂糖樹脂3次；加入等柱床體積的洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，內(nèi)含10 mmol/L GSH）重懸樹脂，室溫孵育10 min后于500 r/min 離心5 min，保留上清；再用等體積的洗脫緩沖液洗脫并離心后合并2次所得上清，即為純化得到的GST-TRAF6融合蛋白；取100 μL該蛋白溶液與等體積2×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸 5-10 min后離心，進(jìn)行SDSPAGE，觀察蛋白純化情況。

1.2.4 GST-TRAF6融合蛋白的Western blot檢測 將純化得到的GST-TRAF6融合蛋白樣品稀釋至終濃度為10 ng/μL，取20 μL稀釋后的蛋白與等體積2×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸 5-10 min后離心，進(jìn)行SDSPAGE電泳后利用半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，轉(zhuǎn)印條件為23 V 1 h；將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜于5%的脫脂奶粉中封閉1 h，將兔源TRAF6抗體按照1∶1 000的比例稀釋后于4℃下孵育PVDF膜過夜；次日，TBST溶液潤洗PVDF膜3次，每次15 min；將潤洗干凈的PVDF膜于室溫下用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1∶5 000）孵育 1 h，TBST溶液分別潤洗3次后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測，并用X光片壓片。

1.2.5 GST-TRAF6 融合蛋白泛素連接酶活性檢測 泛素連接酶活性測定采用Yang等［7］的方法，30 μL反應(yīng)體系包含50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4），2.5 mmol/L MgCl2，50 ng泛素激活酶 E1，300 ng泛素結(jié)合酶UbcH5c，500 ng GST-TRAF6，1 μg泛素，最后加入終濃度為 2 mmol/L的γ-ATP啟動泛素化反應(yīng)。反應(yīng)溫度是37℃，至5、10和20 min時分別從反應(yīng)體系中吸取10 μL反應(yīng)液并迅速加入10 μL 2×SDS載樣緩沖終止反應(yīng)，煮沸5-10 min后離心，利用12.5% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，Western blot方法同1.2.4，一抗為鼠源泛素抗體（稀釋倍數(shù)1∶1 000），二抗為辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗小鼠IgG（稀釋倍數(shù)1∶5 000）。

2 結(jié)果

2.1 TRAF6 基因的擴增

TRAF6 是一個包括522個氨基酸的具有泛素連接酶活性的蛋白質(zhì)。利用TRAF6基因特異性引物從HeLa細(xì)胞 cDNA文庫中以58℃作為退火溫度擴增TRAF6基因片段，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預(yù)期的位置（1 569 bp）上出現(xiàn)一條特異帶（圖1）。

2.2 pGEX-6P-2-TRAF6 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

以限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后得到一條與預(yù)期條帶大小一致的DNA 片段（1 533 bp）（圖2），表明pGEX-6P-2載體上成功插入了TRAF6目標(biāo)基因片段，初步推斷質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)DNA測序鑒定后挑取測序正確的陽性pGEX-6P-2-TRAF6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）中。

2.3 GST-TRAF6融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)以及可溶性檢測

在20℃溫度條件下利用IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)后發(fā)現(xiàn)與未誘導(dǎo)的大腸桿菌相比，0.5 mmol/L IPTG處理誘導(dǎo)了一條分子量介于72-96 kD間的蛋白質(zhì)的表達(dá)，該誘導(dǎo)蛋白的分子量與預(yù)期的GST-TRAF6融合蛋白的分子量（26 kD+62 kD）相近（圖3泳道1和泳道2）。據(jù)此推測，利用0.5 mmol/L IPTG成功誘導(dǎo)了GST-TRAF6融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。將大腸桿菌進(jìn)行超聲破碎后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后發(fā)現(xiàn)在上清和沉淀中均含有表達(dá)的GST-TRAF6融合蛋白（圖3泳道3和泳道4），但是通過比較上清和沉淀樣品中GST-TRAF6融合蛋白的條帶粗細(xì)情況可以看出，上清液中GST-TRAF6融合蛋白的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于包涵體中GST-TRAF6融合蛋白的含量，大部分的GST-TRAF6 融合蛋白在沉淀中以包涵體的形式存在（圖3泳道4），僅有少量的蛋白可溶性地存在于離心后的上清溶液中（圖3泳道3）。

2.4 包涵體中GST-TRAF6融合蛋白的變性、復(fù)性與純化

通過對大腸桿菌包涵體利用洗滌液洗滌后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（圖4泳道1）檢測發(fā)現(xiàn)，GSTTRAF6融合蛋白含量約占包涵體中總蛋白含量的75%以上。將溶解后的包涵體溶液利用復(fù)性液以2倍的梯度進(jìn)行緩慢稀釋復(fù)性，稀釋的過程中肉眼可以觀察到?jīng)]有蛋白質(zhì)沉淀析出，當(dāng)該蛋白溶液被復(fù)性液稀釋至尿素終濃度為0.5 mol/L（相當(dāng)于稀釋16倍）的濃度時，GST-TRAF6融合蛋白仍然保持可溶。將復(fù)性后的溶液進(jìn)一步利用截留分子量為3 kD的超濾濃縮管濃縮10倍后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果（圖4泳道2）顯示，雖然有部分 GST-TRAF6融合蛋白發(fā)生降解，但是仍有大量結(jié)構(gòu)完整的GSTTRAF6融合蛋白。

將濃縮后的GST-TRAF6融合蛋白利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂進(jìn)行親和層析純化，潤洗去除雜蛋白后最終用10 mmol/L還原型谷胱甘肽溶液進(jìn)行目標(biāo)蛋白的洗脫，將洗脫后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果（圖4泳道3）顯示，成功純化到了預(yù)期的目標(biāo)蛋白，僅有一條微弱的雜帶存在，純化蛋白純度達(dá)到90%以上。表明利用親和層析法成功純化得到目標(biāo)蛋白，通過對純化蛋白的濃度進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn)，純化得到的目標(biāo)蛋白的濃度達(dá)到396 ng/μL。

2.5 GST-TRAF6融合蛋白的Western blot檢測

為了進(jìn)一步驗證純化的蛋白確為GST-TRAF6融合蛋白，將純化得到的蛋白稀釋至 10 ng/μL后，取5 μL進(jìn)行Western blot 分析，同時利用等量的GST蛋白作為對照。結(jié)果（圖 5）顯示，利用GST抗體作為一抗成功地將作為對照的GST蛋白以及純化的目標(biāo)蛋白檢測出來，表明本研究中純化的蛋白確為目標(biāo)GST-TRAF6融合蛋白。

2.6 GST-TRAF6融合蛋白泛素連接酶活性檢測

為了驗證包涵體中的GST-TRAF6融合蛋白經(jīng)過變性、復(fù)性步驟后是否具有與天然蛋白一致的酶催化活性，本研究通過體外泛素化反應(yīng)檢測GSTTRAF6融合蛋白的泛素連接酶活性。泛素化反應(yīng)結(jié)果（圖6）顯示，與0 min未發(fā)生反應(yīng)的泛素底物（Ub1）相比，體外泛素化反應(yīng)進(jìn)行 5、10及20 min時均催化了自由泛素鏈的生成，包括泛素二聚體（Ub2）、泛素三聚體（Ub3）、泛素四聚體（Ub4）以及泛素多聚體（Ubn）。而且從圖6中可以看出，泛素化反應(yīng)進(jìn)行5、10及20 min時自由泛素鏈的生成情況基本一致，表明17 ng/μL濃度的 GST-TRAF6融合蛋白在5 min內(nèi)即迅速完成了自由泛素鏈的生成。

3 討論

孫利等［10］曾利用pGEX-4T-2質(zhì)粒作為表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)GST-TRAF6融合蛋白，將大腸桿菌超聲破碎后在可溶性上清中純化該融合蛋白。與本研究的結(jié)果相類似，孫利等［10］的研究結(jié)果表明在大腸桿菌中表達(dá)的GST-TRAF6融合蛋白只有少部分以可溶的形式存在，大部分的融合蛋白以不溶的形式存在于破菌后的沉淀即包涵體中。基于此，本試驗在該研究的基礎(chǔ)上，利用pGEX-6P-2作為表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)，并在大腸桿菌包涵體中分離純化GST-TRAF6融合蛋白的方法。

眾所周知，在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白的過程中由于缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因容易導(dǎo)致包涵體的形成［11］。雖然凝集在包涵體中的蛋白沒有活性，但是在包涵體中表達(dá)的蛋白占總蛋白的50%以上，如果能成功對表達(dá)的目標(biāo)蛋白進(jìn)行溶解和復(fù)性將大大提高純化蛋白的總量以及純度，并減少了細(xì)菌的蛋白酶對目標(biāo)蛋白的降解作用。本研究結(jié)果表明，利用尿素變性、梯度稀釋復(fù)性結(jié)合谷胱甘肽瓊脂糖樹脂親和層析3個步驟在大腸桿菌包涵體中成功地純化到濃度達(dá)到396 ng/μL、純度超過90%、具有高泛素連接酶活性的GST-TRAF6融合蛋白。包涵體表達(dá)的GST-TRAF6融合蛋白分離純化成功的關(guān)鍵是高濃度尿素溶解后包涵體蛋白的復(fù)性。在以往的研究中，包涵體蛋白復(fù)性的手段主要包括：（1）氧化-還原轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的加入，例如在復(fù)性緩沖液中需加入還原型及氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺等給復(fù)性蛋白質(zhì)提供一個氧化還原環(huán)境，促進(jìn)二硫鍵的正確行成；（2）聚乙二醇能夠減少一些蛋白質(zhì)的聚集；（3）分子伴侶和折疊酶等可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性等［12］；（4）柱層析法對包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性［13］。與以往報道的蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)相比較，本研究報道的GST-TRAF6融合蛋白成功復(fù)性的創(chuàng)新之處主要包括兩點：其一是復(fù)性液的構(gòu)成。本研究中的復(fù)性液除了最適宜蛋白質(zhì)復(fù)性的pH8.0外，還含有5%的甘油，一定濃度甘油的加入在一定程度上改變了溶液的極性和滲透壓有利于GST-TRAF6的復(fù)性。同時復(fù)性液中含有少量的DTT，改變?nèi)芤旱难趸€原系統(tǒng)進(jìn)而提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率，利用該復(fù)性液我們曾經(jīng)成功復(fù)性過釀酒酵母PTC6蛋白［14］。其二是復(fù)性的過程采用的是梯度逐級稀釋的方法，該稀釋方法為蛋白質(zhì)的復(fù)性提供了緩慢變化的蛋白質(zhì)溶液外環(huán)境以及更充分的復(fù)性時間。當(dāng)我們利用復(fù)性液作為透析液對尿素溶解后的包涵體溶液直接進(jìn)行透析復(fù)性時發(fā)現(xiàn)，可能由于尿素去除的速度太快導(dǎo)致大量的蛋白從溶液中析出，出現(xiàn)絮狀沉淀（結(jié)果未列），表明緩慢稀釋復(fù)性對于GST-TRAF6融合蛋白的復(fù)性是更具可行性的方法。

由于泛素連接酶的酶活性檢測均為基于Western blot的方法，無法測定其活力與比活力。為此，分析了前人在研究中利用TRAF6蛋白催化體外泛素化反應(yīng)的濃度。Zhang等［15］發(fā)現(xiàn)，在20 μL的泛素化反應(yīng)體系中加入了0.3 μg TRAF6蛋白進(jìn)行泛素化反應(yīng)，該濃度相當(dāng)于15 ng/μL，與本研究中的17 ng/μL的TRAF6蛋白濃度相近。Xia等［16］進(jìn)行TRAF6催化的自由泛素鏈生成的體外反應(yīng)中，TRAF6蛋白的濃度為0.4 μmol/L，而本研究中17 ng/μL的TRAF6蛋白的濃度經(jīng)過換算后摩爾濃度為0.2 μmol/L，即相當(dāng)于Xia等［16］的體外泛素化反應(yīng)體系中TRAF6蛋白濃度的一半。以上結(jié)果表明，包涵體表達(dá)的GSTTRAF6蛋白經(jīng)變性、復(fù)性恢復(fù)了較高的生物學(xué)活性。

從包涵體中純化蛋白是生物制藥領(lǐng)域常用的而且成本較低的純化手段［17］，本研究在獲得成功復(fù)性的 GST-TRAF6 融合蛋白的基礎(chǔ)上，同時提供了一種能夠廣泛用于包涵體蛋白分離純化的復(fù)性技術(shù)和手段，為大規(guī)模低成本純化蛋白提供了一種新的手段和方法。

4 結(jié)論

本研究利用8 mol/L 尿素溶液變性、梯度稀釋復(fù)性和谷胱甘肽瓊脂糖親和層析3個步驟從大腸桿菌包涵體中成功分離純化得到純度達(dá)90%以上、濃度為396 ng/μL的GST-TRAF6蛋白質(zhì)溶液。進(jìn)一步利用體外泛素化反應(yīng)分析其活性發(fā)現(xiàn)，17 ng/μL濃度的GST-TRAF6蛋白能夠以泛素分子為底物在5 min內(nèi)快速催化自由泛素鏈的生成，達(dá)到文獻(xiàn)中所報道的TRAF6的酶催化活性水平，為從大腸桿菌包涵體中大規(guī)模分離純化蛋白質(zhì)提供了一種新的復(fù)性方法。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Purification of GST-TRAF6 Fusion Proteins from Inculsion Body Expressed in E. coli

Zhang Xixuan Li Ye Zhang Zhenqi Dong Shirui Zhao Pei Ruan Haihua
（Tianjin Key Laboratory of Food Science＆Biotechnology，College of Biotechnology＆Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134）

There was only a minor fraction of GST-TRAF6 fusion proteins were observed soluble when expressed inE.coli. Most of the GST-TRAF6 fusion proteins were present in the inclusion body, in which the expressed proteins aggregate and exist in inactive. To obtain GST-TRAF6 fusion protein in a high yield and high purity, a method to purify the GST-TRAF6 fusion proteins from inclusion body without any loss of its bioactivity was constructed. Firstly, the inclusion body was denatured with 8 mol/L urea. Secondly, the GST-TRAF6 fusion protein in inclusion body were gradually solubilized by gradient dilution renaturation. Once the GST-TRAF6 fusion protein was fully dissolved in renaturation solution, it was conventional to purify the GST-TRAF6 fusion protein with glutathione sepharose 4B. The specificity and the bioactivity of the purified GST-TRAF6 fusion protein were testified by western blot andin vitroubiquitination assay, respectively. The results indicated that GST-TRAF6 fusion protein were successfully solubilized by gradient dilution renaturation following the denaturation of 8 mol/L urea, the concentration of the purified GST-TRAF6 fusion protein was achieved a concentration of 396 ng/μL with a purity over 90%. The specificity of this GST-TRAF6 fusion proteins were identified with anti-GST western blot.In vitroubiquitination assay indicated that the GSTTRAF6 fusion protein in a concentration of 17 ng/μL could rapidly catalyze the formation of free ubiquitin chains within 5 minutes. In conclusion, it was found that the GST-TRAF6 fusion protein could be successfully renatured with the method of gradient dilution renaturation with the recovery of its capability of ubiquitin ligase. This results would supply a useful method for the large-scale purification of proteins from inclusion body when expressed inE. coli.

TRAF6 Protein purification Inclusion body renaturation Recombinant protein

2014-01-23

國家自然科學(xué)基金項目（81101220），天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目（12JCQNJC08100），“十二五”天津市中青年骨干創(chuàng)新人才支持計劃，天津市教委高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計劃項目（20130624）

張西軒，男，碩士研究生，研究方向：病原微生物與基因工程；E-mail：xixuanzhang@163.com

阮海華，博士，副教授，研究方向：病原微生物與基因工程；E-mail：ruanhaihua@tjcu.edu.cn