酵母中性脂快速檢測及積累動態(tài)分析

杜秀秀 房志家 陳忠翔 匡鑫 黃志偉

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

酵母中性脂快速檢測及積累動態(tài)分析

杜秀秀 房志家 陳忠翔 匡鑫 黃志偉

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

以油紅O、蘇丹黑B為染料，結(jié)合酸或堿熱破壁萃取，建立了通過比色快速檢測酵母中性脂含量的方法。其中油紅O萃取效果較好，比色結(jié)果更加準確，蘇丹黑B也可以作為一種替代的中性脂含量檢測的染料。并用該方法初步研究了兩種中性脂肪甘油三酯代謝調(diào)控的關(guān)鍵基因磷脂酸磷酸酶（PAH1）和甘油三酯脂酶（triglyceride lipase，TGL）敲除突變體中性脂的變化。結(jié)果顯示，前者甘油三酯顯著降低，但總中性脂肪含量不變，后者甘油三酯及總中性脂肪含量均明顯積累；同時，用該方法監(jiān)測了酵母中性脂含量隨生長周期的動態(tài)變化，表明指數(shù)生長期后有明顯的積累。

出芽酵母 中性脂 親脂染料 脂肪代謝調(diào)控

微生物油脂，又稱單細胞油脂（Single cell oill，SCO），能進行工業(yè)化規(guī)模開發(fā)和生產(chǎn)，不與食用油資源形成競爭，有著巨大的市場潛力，可能在未來生物柴油產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮非常重要的作用［1，2］。其中酵母油脂的脂肪酸組成和一般植物油相近，油脂產(chǎn)量和生物量都比較高，產(chǎn)油量可達到細胞干重的70%以上，被認為是可以生產(chǎn)生物柴油的理想原料［2-4］。

但目前對于酵母細胞中性脂含量的檢測主要是提取總類脂后通過薄層層析法［5，6］分析，而油脂提取需要使用有毒性的有機溶劑，對菌體的量要求較大，且薄層層析有時只能進行相對定量；或是通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［7］定量分析，該方法對于樣品的準備及儀器設(shè)備要求較高。油紅O是一種高效廉價的脂溶性偶氮染料，可特異性使中性脂類物質(zhì)著色，染色程度與胞內(nèi)脂質(zhì)含量呈正相關(guān)性，利用乙醇或異丙醇萃取吸附的染料，根據(jù)標準曲線線性回歸方程可計算脂質(zhì)含量［8］。該方法的可靠性已在哺乳細胞得到驗證，并用于脂肪細胞分化［8，9］和脂肪沉積［10，11］等相關(guān)的研究中。酵母油脂的主要成分是甘油三酯，利用基因工程或代謝工程對酵母菌株進行改造，可提高其產(chǎn)油能力［12］。研究表明，酵母中甘油三酯的合成較大程度上受到PAH1編碼的磷脂酸磷酸酶的調(diào)控，PAH1缺陷會導(dǎo)致脂肪酸代謝障礙［7，13］；而甘油三酯的水解依賴于甘油三酯脂酶TGL家族，其中主要是TGL3、TGL4，兩者缺陷會形成肥胖酵母［13，14］。

本研究將油紅O比色法應(yīng)用到酵母中性脂的檢測中，在酵母細胞中進行PAH1及TGL3、TGL4基因敲除突變體中性脂變化的初步探究和驗證，并針對酵母細胞壁厚萃取困難對染色方法進行改進，旨在建立油紅O染色快速特異檢測酵母細胞中性脂含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 釀酒酵母BY4741、WT-vector、pah1-vector、pah1-Lipin1、tgl3/tgl4-vector本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基［14］；酵母選擇性營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基（SC-Ura培養(yǎng)基），從完全合成SC培養(yǎng)基［15，16］中去除尿嘧啶。

1.1.3 試劑 無水乙醇、乙醚（常熟市楊園化工有限公司），異丙醇、甲醇、乙酸（昆山晶科微電子材料有限公司），氯仿、正己烷（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），三油酸甘油酯（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），蘇丹黑B（上海生物工程公司），油紅O（沃凱化學(xué)試劑公司），甘油三酯試劑盒（上海玉蘭生物技術(shù)有限公司）。

1.1.4 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；熒光顯微鏡，OLYMPUS；UV-2100紫外可見分光光度計，優(yōu)尼科公司；ZHWY-1102C雙層小容量恒溫搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；靜音混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平，DENVER INSTRUMENT；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；薄層層析硅膠板HSGF-254，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；點樣毛細管，上海欣鵬玻璃儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油紅O和蘇丹黑B吸收峰全波長掃描 在聚丙烯管中加入一定量的甘油三酯儲液，待正己烷揮發(fā)后加入足量染色液染色。小心移去染料，用蒸餾水漂洗兩次。在32℃恒溫干燥的環(huán)境中揮發(fā)除去多余的水分，加入1 mL無水乙醇充分萃取吸附的油紅O或蘇丹黑B，在紫外可見分光光度計中進行全波長吸收峰的掃描。

1.2.2 標準曲線制作［8］將三油酸甘油酯溶解在正己烷中配成終濃度為25 mg/mL的儲液，-20℃保存。取整數(shù)倍體積的儲液于聚丙烯管中，待正己烷自然揮發(fā)完后加入足量的油紅O工作液或蘇丹黑B工作液染色2 h。小心移去染料，用蒸餾水漂洗兩次去除未結(jié)合的多余染料。在32℃恒溫干燥的環(huán)境中揮發(fā)除去多余的水分，加入1 mL無水乙醇充分萃取吸附的油紅O或蘇丹黑B，在510 nm或598 nm下測其吸光值。

油紅O工作液的配制［8］：稱取0.7 g油紅O粉末，充分溶解于200 mL異丙醇中，室溫放置過夜，不攪拌，中性濾紙常壓過濾；向濾液中加入150 mL蒸餾水，4℃放置過夜，無攪拌，中性濾紙常壓過濾2次。此濾液即為工作液，可室溫保存6-8個月。

蘇丹黑B工作液的配制［17］：稱取0.3 g蘇丹黑B粉末，溶于100 mL 70%（V/V）乙醇中，室溫放置4-6 d，期間經(jīng)常搖動，使其充分溶解后過濾，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酵母細胞中性脂的比色測定方法 取適量培養(yǎng)的酵母菌液，5 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗兩遍，離心除去多余的水分。加入適量的油紅O工作液，震蕩混勻，使酵母細胞充分接觸染液，混合器震蕩染色2 h。5 000 r/min離心5 min除去染液，酵母細胞沉淀物用蒸餾水充分洗滌3次，去除多余的染料。離心除去多余的水分，加入200 μL 0.1 mol/L的HCl溶液，800 μL無水乙醇，震蕩混勻后，沸水浴加熱3-5 min，冷卻后，5 000 r/min離心5 min，取萃取液于510 nm處測定其吸光值。

蘇丹黑B的染色方法同油紅O，染色后的酵母菌用50%乙醇（V/V）洗滌3次。離心除去多余的水分，加入200 μL 0.1 mol/L的NaOH溶液，800 μL無水乙醇，震蕩混勻后室溫放置30 min，沸水浴加熱5-10 min，冷卻后，5 000 r/min離心5 min，取萃取液于598 nm處測定其吸光值。

1.2.4 三酰甘油試劑盒檢測酵母細胞內(nèi)的TAG 將培養(yǎng)好的菌液倒入離心杯中，5 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗兩次除去游離的甘油，將菌體轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，準確稱取0.2 g濕菌重的菌體。加入1 mL pH7的磷酸緩沖液，加入8 mg蝸牛酶［18］（配成40 mg/mL的母液），30℃處理1 h。將菌液轉(zhuǎn)移到玻璃燒杯中，加入適量的緩沖液，用超聲波細胞破碎器處理1 h，通過超聲波高頻振動產(chǎn)生的機械效應(yīng)和空化效應(yīng)達到破碎細胞釋放油脂的目的。將細胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上清用于檢測。檢測步驟按照試劑盒使用說明書操作如下。

取1 mL的甘油三酯檢測試劑，測定管加入10 μL待測樣品；標準管加入10 μL甘油三酯標準液；空白管加入10 μL蒸餾水?；旌?，置于37℃水浴10 min，以空白管調(diào)零，在546 nm下以比色讀取各管的吸光度值，并計算甘油三酯含量。脂。用點樣器取適量溶液進行點樣。先用氯仿∶丙酮∶甲醇∶乙酸：水（50∶20∶10∶10∶5）作為展層劑，展至一半取出吹干；再用己烷∶乙醚∶乙酸（80∶40∶1）作為展層劑，展至全長。待擴展劑揮發(fā)后，置于碘缸中顯色并拍照。用Band Scan軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 油紅O和蘇丹黑B吸收峰全波長掃描圖譜

利用紫外可見分光光度計從190-1 100 nm對油紅O和蘇丹黑B染色后的乙醇提取液進行波長掃描，以獲得其最大吸收波長（圖1）。結(jié)果顯示，油紅O有兩個吸收峰，分別是350 nm和510 nm，其中510 nm為主吸收峰（圖1-A），與查閱的文獻中一致，故之后在此波長下進行比色測定吸光度值；蘇丹黑B的主吸收峰在598 nm處（圖1-B），故之后在此波長下進行比色。

其中，AT為測定管吸光度，AS為標準管吸光度，CS為標準品濃度。

1.2.5 油脂的提取 將培養(yǎng)好的菌液倒入離心杯中，5 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗兩次，將菌體轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，準確稱取0.1 g濕菌重的菌體。加入1 mL pH7的磷酸緩沖液，加入4 mg蝸牛酶［7，18］（配成40 mg/mL的母液），30℃處理1 h。離心保留菌體，加入1 mL甲醇∶氯仿（2∶1，V/V），和適量的玻璃珠，渦旋振蕩1 h，充分抽提油脂。離心，將上層抽提液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中。加入500 μL 50 mmol/L的檸檬酸和500 μL的氯仿，混合后離心，取下層減壓蒸去溶劑，得到總類脂，置于-20℃冰箱保存［19］。

1.2.6 薄層層析分析中性脂［20］向油脂收集管中加入30 μL的甲醇∶氯仿（2∶1，V/V），混勻溶解油

2.2 三酰甘油的油紅O及蘇丹黑B染色標準曲線

分別用油紅O和蘇丹黑B對不同含量的三油酸甘油酯進行染色，通過乙醇萃取吸附的染料，然后分別在510 nm和598 nm下測定油紅O和蘇丹黑B的吸光度值。以三油酸甘油酯的含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制得到相應(yīng)的標準曲線（圖2）。甘油三酯用油紅O染色后得到的標準曲線線性回歸方程為y=0.0028x（R2=0.997）（圖2-A），甘油三酯用蘇丹黑B染色后得到標準曲線線性回歸方程y=0.0111x（R2=0.9981）（圖2-B）。兩種染色方法得到的甘油三酯含量與吸光度值均呈顯著正相關(guān)性，因此，兩個線性回歸方程均能用于之后中性脂含量的計算。

2.3 不同酵母突變體中性脂累積及定量測定

分別采用油紅O染色法，蘇丹黑B染色法，以及甘油三酯試劑盒測定甘油三酯含量與薄層層析分析酵母菌甘油三酯與麥角固醇酯的比例結(jié)合的方法，測定了WT-vector、pah1△-vector、pah1△-Lipin1、tgl3/tgl4-vector 4種菌株中性脂的含量（表1）。PAH1編碼的磷脂酸磷酸酶及TGL3、TGL4編碼的甘油三酯脂酶是甘油三酯代謝調(diào)控的關(guān)鍵基因（圖3）。對酵母細胞破碎后使用甘油三酯試劑盒測定4種菌株TAG含量，結(jié)果顯示，48h培養(yǎng)后的甘油三酯合成關(guān)鍵酶PAH1缺陷菌株pah1△-vector的TAG含量比野生型菌株WT-vector降低了46%；重新轉(zhuǎn)入其在人類的同源基因LIPIN1的高表達質(zhì)粒，菌株pah1△-Lipin1的甘油三酯含量比野生型菌株還要高一些；甘油三酯脂酶TGL3和TGL4的缺陷菌株tgl3/tgl4△-vector的甘油三酯含量明顯高于野生型菌株。提取4種菌株總類脂后，薄層層析分析了樣品中甘油三酯與甾醇酯的比例，進而計算出每種菌株總中性脂的含量。pah1△-vector菌株盡管甘油三酯含量明顯減少，但其甾醇酯比例高，故總中性脂水平?jīng)]有改變。而pah1△-Lipin1和tgl3/tgl4△-vector菌株的總中性脂含量均較野生型菌株明顯提高。利用油紅O染色后，在酸熱作用下乙醇萃取吸附的染料，萃取效果極佳，于510 nm處比色法測得的4種菌株中性脂含量與用上面方法得出的結(jié)果具有較高的一致性。由于酵母細胞壁較厚，直接萃取效果較差，利用酸熱法破碎細胞壁能顯著提高萃取效果，使測定結(jié)果更加準確，故改進后的方法可用于檢測酵母菌中性脂含量。蘇丹黑B染色后，對細胞著色較深，萃取更加困難，雖然延長了萃取時間及堿熱處理時間，萃取效果仍沒有油紅O好，因此其比色結(jié)果反而比油紅O比色法更低一些，可作為酵母總脂或中性脂的估測方法。

2.4 油紅O和蘇丹黑B染色顯微觀察定性分析中性脂累積

脂滴是中性脂的主要貯存場所，油紅O和蘇丹黑B是脂滴染色觀察的常用染料。采用與定量測定相同的染色處理后，將酵母細胞制片在顯微鏡下觀察并拍照（圖4）。4種菌株被蘇丹黑B染色后，胞內(nèi)的脂滴呈現(xiàn)藍黑色；被油紅O染色，在熒光顯微鏡下觀察胞內(nèi)脂滴成亮紅色，對脂滴的觀察比蘇丹黑B更清楚些。脂滴大小不一，散布在細胞質(zhì)中，能明顯看出pah1△-vector 菌株脂滴數(shù)目較野生型WT-vector明顯降低；pah1△-Lipin1、tgl3/tgl4△-vector與WT-vector相比脂滴數(shù)目雖然差異不大，但是脂滴直徑明顯增大，表明有更多的中性脂積累。通過染色，顯微觀察脂滴數(shù)目和大小，只可定性分析中性脂含量。

2.5 酵母不同生長期中性脂積累動態(tài)

培養(yǎng)野生型菌株BY4741到穩(wěn)定期后轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，利用油紅O比色法檢測不同生長階段的中性脂含量，繪出了生長曲線和中性脂含量動態(tài)圖（圖5）。酵母菌的生長周期遵循微生物的生長規(guī)律，在經(jīng)歷了幾個小時的遲緩期后便進入了快速增殖的對數(shù)生長期，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，增殖速度減慢，慢慢進入到穩(wěn)定期（圖5-A）。酵母菌中性脂含量隨生長周期發(fā)生動態(tài)變化（圖5-B），先是在遲緩期緩慢降低，進入對數(shù)生長期后急劇下降用于膜脂的形成和細胞的分裂增殖，隨后中性脂含量慢慢積累，細胞增殖緩慢，在對數(shù)期后期或穩(wěn)定期初期中性脂含量達到最高。

3 討論

脂溶性的油紅O是一種高效廉價的染色劑，能特異性結(jié)合中性脂（甘油酯和甾醇酯），并且在紅光區(qū)域能產(chǎn)生激發(fā)光。利用油紅O染色，在熒光顯微鏡下觀察可定性分析中性脂含量，初步判斷脂質(zhì)聚集情況。油紅O對細胞的染色程度與胞內(nèi)中性脂含量呈正相關(guān)關(guān)系，利用乙醇或異丙醇將吸附的染料萃取出來，在510 nm下測定吸光度值，由線性回歸方程計算出中性脂含量，能對胞內(nèi)中性脂進行定量分析。針對酵母細胞壁厚，有機溶劑直接萃取效果差，本研究結(jié)合酸熱法破壁，利用鹽酸破壞細胞壁中的蛋白質(zhì)和糖，使密致緊湊的細胞壁變得疏松，沸水浴進一步破壞細胞壁的完整性，能夠達到快速高效的萃取結(jié)果。采用3種方法同時測定了4種酵母菌株中性脂的含量。甘油三酯試劑盒采用GPOPAP酶法測定甘油三酯（TAG）的含量，不僅作為輔助診斷，用于臨床醫(yī)療機構(gòu)檢測人血清、血漿或組織中甘油三酯的濃度，而且已用于科研工作中檢測脂肪沉積情況［21］。甘油三酯試劑盒結(jié)合薄層層析法的測定值可作為參考值，用改進后的油紅O比色法測定的結(jié)果與參考值具有較高的一致性，證明該方法用于檢測酵母細胞中性脂含量具有較高的可靠性。同時我們使用了另一種親脂染料蘇丹黑B，其對中性脂和極性脂均可著色，常用于總脂的分析［20］，該方法測得的中性脂含量與參考值也具有較高的一致性，但是由于其對細胞的著色較深及其親脂性質(zhì)，雖然延長了萃取時間和堿熱處理時間也不能夠完全萃取，因此降低了結(jié)果的可靠性，但可作為酵母中性脂含量的估測。本研究建立的油紅O比色法檢測酵母中性脂含量與以往的方法相比，不僅更加快速方便，僅需少量菌體，而且不需要使用有毒性的有機試劑進行繁瑣的油脂提取，對儀器設(shè)備要求低，普通分光光度計即可滿足要求，成本低，基本實驗室均可進行。

磷脂酸磷酸酶PAH1與甘油三酯酯酶TGL3和TGL4對甘油三酯的合成與降解起到重要的調(diào)控作用。使用甘油三酯試劑盒檢測pah1△-vector和tgl3/tgl4△-vector菌株甘油三酯含量，表明PAH1敲除后甘油三酯含量顯著降低，而TGL3和TGL4敲除后甘油三酯含量明顯提高。結(jié)合薄層層析法，tgl3/tgl4△-vector突變體的總中性脂含量也明顯提高，而pah1△-vector突變體由于甾醇酯生成增多，總中性脂含量則表現(xiàn)出與野生型水平相當。用所建立油紅O比色法檢測兩種敲除突變體中性脂的變化，結(jié)果與上述方法一致。而在PAH1敲除菌株中轉(zhuǎn)入其在哺乳動物中的同源基因LTPIN1后，甘油三酯和總中性脂含量均明顯提高。結(jié)果表明，通過基因工程，可改變酵母中性脂肪的組成及含量。因此，利用出芽酵母研究產(chǎn)油機制以提高產(chǎn)油能力具有重要意義。利用脂溶性染料對細胞染色后，觀察中性脂的主要貯存場所脂滴［21］，通過對脂滴數(shù)目和直徑的統(tǒng)計可定性分析中性脂的積累。其中所用菌株pah1△-vector通過油紅O比色法檢測的中性脂含量較野生型WT-vector沒有變化，而脂滴數(shù)目較野生型明顯降低，是由于其中性脂特別是甾醇酯聚集在膜結(jié)構(gòu)中，不能通過顯微觀察到［7］。酵母中性脂隨生長周期表現(xiàn)出動態(tài)變化，在經(jīng)歷了快速增殖的對數(shù)期后中性脂肪大量積累。油紅O比色法能夠成功監(jiān)測到中性脂的積累動態(tài)，可為酵母油脂發(fā)酵時間提供參考。

酵母油脂的主要成分是中性脂，因此測定其中性脂含量對總脂含量的分析有很大參考意義。蘇丹黑B比色法已用于總脂含量的分析中，本研究油紅O的比色值與蘇丹黑B具有較高的一致性，因此該方法也可用于總脂含量的分析中，作為高產(chǎn)油脂菌株篩選的新的檢測手段。

4 結(jié)論

采用酸熱法破碎細胞壁，能夠完全萃取染色細胞中吸附的油紅O，克服了直接萃取不完全，測定不準確的問題。利用甘油三酯試劑盒結(jié)合薄層層析法，驗證了改進后的油紅O比色法檢測酵母中性脂含量的可靠性。該方法能夠?qū)Σ煌湍竿蛔凅w中性脂進行定量分析，并成功監(jiān)測酵母中性脂隨生長周期的積累動態(tài)。因此，本研究建立的方法可用于酵母中性脂的快速檢測，為高產(chǎn)油脂酵母菌株的選育及發(fā)酵控制提供一種新的檢測方法。

［1］王強, 封穎.我國生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因素研究［J］.中國科技成果, 2009, 2：40-42.

［2］Tyson KS, Bozell J, Wallace R, et al. Biomass oil analysis：Research needs and recommendations［R］. NREL/TP-510-34796, 2004.

［3］張國玲, 杜偉, 劉德華.酵母油脂及用于生物柴油制備的研究進展［J］.化工進展, 2013, 32（4）：791-798.

［4］Meng X, Yang J, Xu X, et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms［J］. Renewable Energy, 2009, 34：1-5.

［5］Han GS, Wu WI, Carman GM. The Saccharomyces cerevisiae lipin homolog is a Mg2+-dependent phosphatidate phosphatase enzyme［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2006, 281（14）：9210-9218.

［6］Athenstaedt K, Zweytick D, Jandrositz A, et al. Identification and characterization of major lipid particle proteins of the yeastSaccharomyces cerevisiae［J］. J Bacteriol, 1999, 181（20）：6441-6448.

［7］Adeyo O, Horn PJ, Lee SK, et al. The yeast lipin orthologue Pah1p is important for biogenesis of lipid droplets［J］. J Cell Biol, 2011, 192（6）：1043-1055.

［8］Ramirez-Zacarias JL, Castro-Mufiozledo F, Kuri-Harcuch W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with Oil red O［J］. Histochemistry, 1992, 97（6）：493-497.

［9］趙晶晶, 魏明, 呂艷青, 等.齊墩果酸對3T3-L1脂肪細胞分化及糖脂代謝的影響［J］.中藥材, 2011, 34（4）：588-592.

［10］于渤洋, 呂文濤, 巨婷婷, 等.腺苷甲硫氨酸對成肌細胞成脂分化及脂肪沉積的影響［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45（18）：3841-3848.

［11］鄭小紅, 李偉, 張昕宇, 等.新型手性抗腫瘤藥物德氮吡格體外抗腫瘤活性初步研究［J］.世界科技研究與發(fā)展, 2011, 33（3）：477-480.

［12］Li Q, Du W, Liu DH. Perspectives of microbial oils for biodiesel production［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 80：749-756.

［13］Kohlwein SD. Triacylglycerol homeostasis：Insights from yeast［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2010, 285（21）：15663-15667.

［14］Kurat CF, Natter K, Petschnigg J, et al. Obese yeast：Triglyceride lipolysis is functionally conserved from mammals to yeast［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2006, 281：491-500.

［15］林汝榕, 邢炳鵬, 蔡文旋, 等.蘇丹黑B染色處理細胞技術(shù)在快速檢測微藻油脂含量中的應(yīng)用［J］.臺灣海峽, 2011, 30（2）：292-298.

［16］中國科學(xué)院生物物理研究所三室.蝸牛酶的制備和對酵母細胞壁的作用［J］.生物化學(xué)與生物物理進展, 1978.

［17］Bligh EG, Dyer WJ. A rapid method of total lipid extraction and purification［J］. Can J Biochem Physiol, 1959, 37（8）：911-917.

［18］Yazawa H, Kumagai H, Uemura H. Characterization of triglyceride lipase genes of fission yeastSchizosaccharomyces pombe［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 96（4）：981-991.

［19］萬穎, 房殿亮, 沈薇, 寧波.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝細胞脂肪沉積及可能機制［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2012, 33（10）：1055-1059.

［20］ 董欣榮, 曹健, 趙斌, 許偉華.幾種真菌油脂的檢測與提?。跩］.鄭州工程學(xué)院學(xué)報, 2002, 23（1）：14-18.

［21］Murphy DJ. The biogenesis and functions of lipid bodies in animals, plants and microorganisms［J］. Prog Lipid Res, 2001, 40（5）：325-438.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Rapid Quantitation and Dynamic Accumulation Analysis of Neutral Lipids in Yeast

Du Xiuxiu Fang Zhijia Chen Zhongxiang Kuang Xin Huang Zhiwei
（College of Chemistry & Chemical Engineering and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620）

A colorimetric method for rapidly detecting neutral lipid content in yeast was developed, which was based on the staining of yeast cells by lipophilic dyes Oil red O or Sudan Black B and extraction with ethanol after cell rupturing using the method of combining hydrochloric acid or sodium hydroxide with heating. The extraction of Oil red O is better and the colorimetric results were more accurate, while Sudan Black B also can be used as an alternative dye for estimating neutral lipid content. Furthermore, the changes of neutral lipids in yeast mutated phospholipid fatty acid phosphatase（PAH1）and triglyceride lipase（TGL）, which are known as two key genes to regulate triglyceride metabolism, were studied using this method. Disruption of PAH1 resulted in a remarkable decrease in triglyceride content, although total neutral lipid levels did not change；while triglyceride and total neutral lipids contents were significantly accumulated in TGL knockout mutant. Finally, the dynamic changes of yeast neutral lipids content were successfully monitored with the change of growth phase by this method, suggesting that the neutral lipids were obviously accumulated after exponential phase.

Saccharomyces cerevisiaeNeutral lipids Lipophilic dyes Regulation of lipid metabolism

2013-12-18

國家自然科學(xué)基金項目（31100549），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（22320143-03）

杜秀秀，女，碩士生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：duxiuxiu55@163.com

黃志偉，男，副教授，研究方向：分子遺傳學(xué)；E-mail：zhiweih@dhu.edu.cn