食源性沙門氏菌耐藥性及質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因檢測

劉貴深于濤

（1.潮州市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，潮州 521011；2.新鄉(xiāng)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000）

食源性沙門氏菌耐藥性及質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因檢測

劉貴深1于濤2

（1.潮州市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，潮州 521011；2.新鄉(xiāng)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000）

隨機采集的638份食品樣品中沙門氏菌總檢出率為9.7%（n=62株），共檢出16種不同的血清型，其中最常見的為鴨沙門氏菌。受試菌株對磺胺甲基異噁唑、復(fù)方新諾明、鏈霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率較高。16株耐環(huán)丙沙星沙門氏菌按GyrA和ParC喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）不同氨基酸替代組合可分為5種突變型，其中GyrA亞基發(fā)生Ser83Phe和Asp87Gly變異，同時ParC亞基發(fā)生Ser80Arg變異為最常見的突變類型。62株食源性沙門氏菌中，qnr基因陽性的菌株共7株，占受試菌株的11.3%。qnrA和qnrS基因陽性菌株分別有2株和5株，沒有菌株攜帶qnrB、qnrC和qnrD基因。aac（6'）-Ib基因陽性菌株共有8株，其中3株經(jīng)確認為攜帶其變體基因aac（6'）-Ib-cr。結(jié)果表明，新鄉(xiāng)市食源性沙門氏菌血清型分布呈多樣性，耐藥狀況較為嚴重，并且一些菌株攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥（PMQR）基因。

食源性 沙門氏菌 耐藥性 質(zhì)粒介導(dǎo) 喹諾酮類

沙門氏菌是一種重要的食源性致病菌。資料顯示，中國70%-80%的細菌性食物中毒是由沙門氏菌引起的，沙門氏菌作為食源性致病菌所引起的危害在不斷擴大［1-3］。沙門氏菌的許多血清型，如腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，均可導(dǎo)致宿主產(chǎn)生腹瀉等食源性疾?。?］。近年來，由于抗生素在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和臨床治療中的廣泛使用甚至是不遵守規(guī)則的濫用，導(dǎo)致沙門氏菌的耐藥性問題日益嚴重［5，6］。喹諾酮類抗生素是由萘啶酸發(fā)展起來的全合成抗菌藥物，具有獨特的作用機制、優(yōu)秀的藥物動力學(xué)性能和抗菌活性等特性，已成為人類臨床及動物疾病治療和預(yù)防的常用藥物。以往研究顯示，沙門氏菌對喹諾酮類的耐藥主要由喹諾酮耐藥決定區(qū)（Quinolone resistance-determining region，QRDR） 的靶位改變和主動外排所致，兩者均由染色體介導(dǎo)［7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥（Plasmidmediated quinolone resistance，PMQR）是其耐藥性傳播的主要途徑［7］?，F(xiàn)已報道的PMQR機制有3類，即qnr家族、aac（6'）-Ib-cr和喹諾酮類藥物特異性外排泵qepA。然而，目前對沙門氏菌PMQR機制的研究多集中于人類臨床分離株，對食源性沙門氏菌的報道較少。

細菌耐藥菌株的傳播和多重耐藥菌株的出現(xiàn)是導(dǎo)致各類傳染病治愈率受限制的主要原因之一［8］，且耐藥菌株可以通過多種途徑傳播并經(jīng)食物鏈進入人體。研究食源性沙門氏菌的藥敏特征及耐藥機制有助于從食物鏈的源頭和食品性動物生產(chǎn)中采取合理的干預(yù)措施，從而減少和防止沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生，保障食品安全。為此，本研究對新鄉(xiāng)市4類食品樣品中沙門氏菌的污染狀況進行了調(diào)查，分析菌株的血清分布和耐藥性；同時對食源性沙門氏菌的QRDR靶位突變以及PMQR的流行情況進行檢測，旨在更好地了解食源性沙門氏菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 以新鄉(xiāng)市農(nóng)貿(mào)市場、超市、大賣場和部分副食品經(jīng)營單位為對象，按照隨機采樣原則和食品微生物學(xué)檢驗采樣的要求，共采集4類食品樣品638份，其中生肉367份（包括豬肉、牛肉、雞肉和羊肉），水產(chǎn)品73份，蔬菜98份，熟肉制品100份。

1.1.2 標準菌株 沙門氏菌標準菌株ATCC 50041、大腸桿菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853：中華人民共和國衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑 培養(yǎng)基，北京陸橋生物技術(shù)有限公司；生化鑒定試劑條，法國梅里埃公司；沙門氏診斷血清，泰國A&S公司；藥敏紙片，北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；用于PCR擴增的試劑，大連寶生物工程有限公司；擴增引物，上海英駿生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 JC303型電熱隔水式培養(yǎng)箱，上海嘉程儀器設(shè)備廠；ATS-032型空氣浴搖床，上海堪鑫儀器設(shè)備有限公司；BagMixer lab blender 400均質(zhì)器，法國Interscience公司；基因擴增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)，北京炳洋科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品中沙門氏菌的分離鑒定 按照GB 4789.4-2010規(guī)定的方法對樣品進行沙門氏菌的分離與鑒定。試驗過程以沙門氏菌標準菌株ATCC 50041作為陽性對照。

1.2.2 藥敏試驗 按照WHO推薦的K-B瓊脂紙片擴散法進行，結(jié)果判定依照美國臨床實驗室標準委員會（CLSI）2010版方法手冊進行。每批試驗均用大腸桿菌ATCC 25922銅綠假單胞菌ATCC 27853進行質(zhì)量控制。

1.2.3 DNA模板的制備 采用煮沸法提取細菌DNA作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.4 PCR擴增 DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶IVgyrA、gyrB、parC和parE基因的引物設(shè)計參照文獻［1］，引物序列見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進行DNA序列雙向測定。所測序列采用DNA star軟件進行序列拼接和氨基酸序列的推導(dǎo)，并應(yīng)用BLAST軟件將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性分析比對。

1.2.5 PCR擴增PMQR基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS和aac（6'）-Ib基因的引物設(shè)計參照文獻［9-11］，引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1 食品樣品中沙門氏菌的分離情況

638份樣品中共檢出沙門氏菌62株，總檢出率為9.7%（表2）。367份生肉樣品中檢出沙門氏菌46株，檢出率達12.5%；73份水產(chǎn)品中檢出沙門氏菌5株，檢出率為6.8%；98份蔬菜樣品中檢出沙門氏菌2株，檢出率為2.0%；100份熟肉制品中檢出沙門氏菌9株，檢出率為9.0%。

2.2 食品樣品中沙門氏菌的血清型分布

62株沙門氏菌中共檢出16個不同的血清型（表3），其中較為常見的有鴨沙門氏菌（22.6%）、山夫登堡沙門氏菌（17.7%）、德爾卑沙門氏菌（12.9%）和腸炎沙門氏菌（8.1%）。

2.3 沙門氏菌對抗生素的敏感性結(jié)果

本研究中耐藥率為耐藥和中介耐藥的菌株在所有菌株中所占的比例，沙門氏菌對21種抗生素的敏感性結(jié)果（圖1）表明，62株沙門氏菌對磺胺甲基異噁唑的耐藥率最高，達90.3%；其次分別為復(fù)方新諾明（87.1%）、鏈霉素（33.0%）、環(huán)丙沙星（25.8%）、氨芐西林（22.9%）、氯霉素（21.0%）和四環(huán)素（17.7%）。受試菌株對頭孢噻吩和慶大霉素最敏感，無耐藥菌株出現(xiàn)。

62株受試菌株中，除4株（6.5%）對供試的所有抗生素均表現(xiàn)敏感外，其余58株（93.5%）至少對1種抗生素表現(xiàn)耐藥。對1-3種抗生素表現(xiàn)耐藥的菌株有33株（53.2%），對4-6種抗生素表現(xiàn)耐藥的菌株有17株（27.4%），對7-9種抗生素表現(xiàn)耐藥的菌株有8株（12.9%）。對3類或3類以上抗生素表現(xiàn)耐藥性的多重耐藥菌株有21株，占試驗菌株的33.9%（表4）。在多重耐藥菌株中，德爾卑沙門氏菌和腸炎沙門氏菌較為常見。

2.4 沙門氏菌對抗生素的敏感性結(jié)果

62株沙門氏菌中有16株對環(huán)丙沙星耐藥，對這些耐藥菌株進行PCR擴增得到gyrA、gyrB、parC和parE基因擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序后檢出由基因突變引起的氨基酸變異結(jié)果（表5）顯示，16株耐環(huán)丙沙星沙門氏菌的GyrA亞基均出現(xiàn)氨基酸突變，11株在ParC亞基發(fā)生突變，而在GyrB和ParE亞基中未檢出突變。

2.5 沙門氏菌中PMQR基因檢測結(jié)果

62株食源性沙門氏菌中qnr基因陽性菌株共7株，占受試菌株的11.3%。qnrA和qnrS基因陽性菌株分別有2株和5株，沒有菌株攜帶qnrB、qnrC和qnrD基因。aac（6'）-Ib基因陽性菌株共8株，占受試菌株的12.9%，其中3株經(jīng)確認為攜帶其變體基因aac（6'）-Ib-cr。

3 討論

本研究在638份樣品中共檢出62株沙門氏菌，檢出率為9.7%。關(guān)文英等［12］對河北省3類食品調(diào)查發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌總陽性率為20.9%；在楊保偉等［1］對陜西省零售肉類食品和即食涼拌菜研究中，沙門氏菌檢出率為36.8%。同上述地區(qū)的研究結(jié)果相比，本研究中沙門氏菌檢出率較低。值得注意的是，本次檢測的生肉類食品中，污染最嚴重的是牛肉，其次分別為豬肉、羊肉和雞肉，與關(guān)文英等［12］報道的結(jié)果基本一致。所分離沙門氏菌的血清型主要為鴨沙門氏菌、山夫登堡沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，這些被認為是引發(fā)多個國家和地區(qū)腹瀉型疾病的沙門氏菌血清型，在我國其他省份和各類食品中也均有檢出［2］。本研究中，沙門氏菌對除頭孢噻吩和慶大霉素以外的19種抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，其中對磺胺甲基異噁唑、復(fù)方新諾明、鏈霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率較高，并且有33.9%的菌株呈現(xiàn)多重耐藥。

喹諾酮類藥物的作用靶位為DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV，前者由2個GyrA亞基和2個GyrB亞基組成，分別由gyrA和gyrB基因編碼；后者由2個ParC亞基和2個ParE亞基組成，分別由parC和parE基因編碼。DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV的QRDR發(fā)生氨基酸突變可引起酶的結(jié)構(gòu)與功能改變，從而導(dǎo)致細菌對喹諾酮類耐藥。本研究中的數(shù)據(jù)顯示，16株耐環(huán)丙沙星沙門氏菌按GyrA和ParC的QRDR不同氨基酸替代組合可分為5種突變型，其中GyrA亞基發(fā)生Ser83Phe 和Asp87Gly變異，同時ParC亞基發(fā)生Ser80Arg變異為最常見的突變類型。本研究中并未發(fā)現(xiàn)只發(fā)生parC突變而gyrA沒有突變的菌株，與先前的報道結(jié)果一致［13］，這也說明了在喹諾酮耐藥產(chǎn)生的過程中，只有當gyrA突變存在的情況下，parC突變才能發(fā)生并發(fā)揮作用。

PMQR機制的發(fā)現(xiàn)改變了人們長期以來認為喹諾酮類耐藥僅由染色體介導(dǎo)的觀點。PMQR基因分布較為廣泛，在許多國家和地區(qū)的腸桿菌科細菌中均有檢出。除了臨床菌株，從食品動物中分離的腸桿菌科細菌也可檢測到此類基因。Yue等［14］對從廣東省家禽和豬中分離的232株大腸桿菌進行qnr基因篩查，14株陽性菌株中有1株攜帶qnrB，13株攜帶qnrS。Jiang等［15］發(fā)現(xiàn)從養(yǎng)殖魚類中分離的218株大腸桿菌中分別有33株、21株和5株攜帶qnrB、qnrS和qnrD基因。然而關(guān)于PMQR基因在食源性沙門氏菌中的分布卻鮮有報道。Yang等［13］對來自河南省的118株食源性沙門氏菌的研究發(fā)現(xiàn)，qnrA、qnrB、qnrS和aac（6'）-Ib的檢出率分別高達46.6%、12.7%、19.5%和13.6%，遠遠高于本研究的結(jié)果，這可能與地區(qū)差異、菌株數(shù)量有限等因素有關(guān)。

喹諾酮類是合成抗生素，一直被認為不受修飾酶的影響。但在2006年初Robicsek等［16］首次報道了喹諾酮類修飾酶基因aac（6'）-Ib-cr，其本質(zhì)上是一種普通氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac（6'）-Ib的變異體，兩處堿基的突變賦予了其修飾喹諾酮類的特性，兩處變異常同時存在。本研究對aac（6'）-Ib的擴增產(chǎn)物進行測序發(fā)現(xiàn)有3株菌攜帶其變體基因aac（6'）-Ib-cr。PMQR基因?qū)е碌哪退幰话闶堑退降?，但這并不影響它給臨床帶來的危害，因為這些耐藥基因的存在有利于使菌株對喹諾酮類產(chǎn)生高水平的耐藥。PMQR耐藥基因的作用機制不同于其它的喹諾酮類耐藥機制，這使得其能夠在不同細菌中迅速水平傳播而導(dǎo)致更大范圍的流行。同時，由于PMQR耐藥基因常和其它類型的耐藥基因共同存在于同一個質(zhì)粒上，往往造成攜帶該質(zhì)粒的菌株表現(xiàn)出多重耐藥。

4 結(jié)論

本研究從食品中分離的62株沙門氏菌對磺胺甲基異噁唑、復(fù)方新諾明、鏈霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率較高，并且有33.9%的菌株呈現(xiàn)多重耐藥。16株耐環(huán)丙沙星的沙門氏菌中GyrA亞基發(fā)生Ser83Phe和Asp87Gly變異，同時ParC亞基發(fā)生Ser80Arg變異為最常見的突變類型。62株菌中qnr基因陽性菌株共有7株，其中qnrA和qnrS基因陽性菌株分別有2株和5株。aac（6'）-Ib基因陽性菌株共有8株，其中3株經(jīng)確認為攜帶其變體基因aac（6'）-Ib-cr。

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（責任編輯 馬鑫）

Study on Antimicrobial Resistance and Plasmid-mediated Quinolone Resistance of Foodborne Salmonella Isolates

Liu Guishen1Yu Tao2
（1. Chaozhou Institute of Measurement and Testing Technology，Chaozhou 521011；2. Xinxiang University，Xinxiang 453000）

A total of 638 food samples were collected randomly to determine the prevalence ofSalmonella.The overall percentage ofSalmonellaprevalence was 9.7%（n=62）. Among 16 different serotypes identified,S. Anatum was most common. The isolates were frequently resistant to sulfamethoxazole, trimethoprim/sulfamethoxazole, streptomycin, and ciprofloxacin. Five different types of amino acid substitutions were identified in quinolone resistance-determining region（QRDR）of GyrA and ParC of 16 ciprofloxacin-resistant isolates. Double mutations of Ser83Phe and Asp87Gly in GyrA accompanied by an additional mutation of Ser80Arg in ParC were found most frequently. Theqnrgenes were present in seven（11.3%）of 62 isolates, and among them, two isolates carriedqnrAand five carriedqnrS.qnrB,qnrC, andqnrDwere not detected in the isolates in this study. Eight isolates were positive foraac（6'）-Ib, of which three isolates carried the-crvariant. The results suggested the diversity of serotype distribution, serious situation of antimicrobial resistance and the presence of plasmid-mediated quinolone resistance（PMQR）genes in foodborneSalmonellafrom Xinxiang.

FoodborneSalmonellaAntimicrobial resistance Plasmid-mediated Quinolone

2014-01-17

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目（13A610839）

劉貴深，男，高級工程師，研究方向：產(chǎn)品檢驗及質(zhì)量管理；E-mail：suyongyu@126.com

于濤，男，講師，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：yutao7777@hotmail.com