丹 成王 達(dá)桂建芳

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

黃顙魚性別連鎖標(biāo)記Pf62-Y的染色體定位

丹 成1,2王 達(dá)1,2桂建芳1

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco) 隸屬鲇形目、科、黃顙屬, 廣泛分布于我國(guó)各大水域, 是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)魚類之一。桂建芳等[1]進(jìn)行了黃顙魚銀染核型研究, 沈俊寶等[2]也報(bào)道了黃顙魚的核型, 其核型為 2 n=52。劉漢勤等[3]利用人工雌核發(fā)育等技術(shù)開展了全雄黃顙魚研究,認(rèn)為黃顙魚的遺傳性別決定類型為XY雄性異配型, Wang, et al. 在黃顙魚中開展了性別連鎖的DNA標(biāo)記分離研究,篩選得到黃顙魚雌性和雄性連鎖的DNA標(biāo)記, 由此開拓出一條性別連鎖標(biāo)記輔助的全雄黃顙魚培育技術(shù)路線,用于大規(guī)模全雄黃顙魚的商業(yè)生產(chǎn)[4,5]。Pf62-Y作為重要的黃顙魚雄性連鎖標(biāo)記之一, 我們通過對(duì)Pf62-Y的研究,探索黃顙魚的性別決定與分化機(jī)制。

染色體熒光原位雜交(Fluorescent in suit hybriddization, FISH)是以核酸分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ), 在已有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的非放射性原位雜交技術(shù), 目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等各個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域[6]。FISH技術(shù)為基因的物理定位提供了一個(gè)有力的工具, 該技術(shù)也成功地應(yīng)用于單拷貝順序的染色體定位。本研究采用 FISH方法將性染色體連鎖標(biāo)記Pf62-Y在染色體上進(jìn)行定位, 這是首次對(duì)黃顙魚性染色體研究的相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用普通雄性黃顙魚由武漢百瑞生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 探針制備

基因組DNA抽提 剪取黃顙魚尾鰭, 蛋白酶K消化組織塊, Protein Precipitation Solution去除蛋白, 異丙醇沉淀析出 DNA, 70%乙醇漂洗, 用 100 μL TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH=8.0) 溶解。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA完整性, 分光光度計(jì)檢測(cè) DNA 純度和濃度。

探針片段擴(kuò)增和標(biāo)記 采用特異引物設(shè)計(jì)合成和基因組步移技術(shù)[7], 我們獲得了黃顙魚 Pf62-Y側(cè)翼 8.1 kb的DNA片段, 并以此作為原位雜交探針。利用缺刻平移法原理。1 μg的 DNA(16 μL)與抗地高辛熒光素標(biāo)記酶(Cat.No.11 745 816 910, Roche) 4 μL 混合, 15℃反應(yīng)90min。1 μL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0), 65 ℃ 1 0min 終止反應(yīng), –20℃沉淀過夜。

1.3 染色體熒光原位雜交

染色體制片 方法參照Z(yǔ)hu, et al.的報(bào)道[8,9], 略有修改?；铙w注射PHA (10 μg /g魚體重)100—200 μL, PHA處理 6—8h后注射秋水仙素(0.75%NaCl配制, 4 μg/g魚體重)溶液處理 2—4h, 取頭腎組織用 0.07 mol/L的KCl溶液低滲處理, 用新鮮配置固定液(甲醇∶冰乙酸= 3∶1)固定后, 取出王水處理好的玻片置于冰上, 常規(guī)空氣干燥法制片, Giemsa染液染色后顯微鏡下鏡檢染色體分離相。

探針和染色體制片的變性和雜交 60℃烤片 1h后10 μg/mL胃蛋白酶 37℃消化10min, RNaseA (100 μg/mL) 37℃消化 1h后 2×SSC漂洗, 晾干。72℃的 70%甲酰胺/ 2×SSC的變性液中變性3min, 并迅速移入預(yù)冷的70%、95%、100%乙醇中脫水各 5min, 自然干燥。于此同時(shí)探針混合液含 50%去離子甲酰胺, 50%硫酸葡聚糖, 20×SSC和 0.25 mg/mL sssDNA, 100 ng標(biāo)記的染色體DNA, 10% SDS, 于沸水中變性10min, 立即置于冰上至少放置0.5h以上, 使雙鏈 DNA探針變性。冰上攪勻探針,將探針加到變性干燥了的制片上, 蓋上蓋玻片, 不要有氣泡, 于濕盒中37℃避光雜交16—20h。

雜交信號(hào)檢測(cè) 42℃條件下在20%甲酰胺/2×SSC溶液中去掉蓋玻片, 然后依次在 2×SSC溶液、0.1×SSC 溶液中強(qiáng)烈洗脫各15min, 1×PBS漂洗5min漂洗3次。每張玻片加50 μL含1%小牛血清的sheep anti-Dig-FITC 抗體(Cat.11207741910, Roche)稀釋液, 在濕盒中 37℃溫育30—60min, PBS漂洗 3×10min。同樣方法加二抗 rabbit anti-Sheep IgG-FITC (Cat. Sc-2779, Santa Cruz)和三抗goat anti-rabbit IgG-FITC (Cat. Sc-2012), 1×PBS漂洗3×10min。用 2 μg/mL 的 PI (Propidium iodide)或者2 μg/mL的DAPI (4’, 6’-diamidino-2-phenylin-dole)染色10min, PBS漂洗3×5min后, 加抗滅劑封片, 激光共聚焦鏡檢, 拍照。

2 結(jié)果

由于制備的中期分裂相所處時(shí)期的不同和染色體擴(kuò)散的差異, 因而僅有部分中期分裂相中顯現(xiàn)有雜交信號(hào)。我們較詳細(xì)檢測(cè)了兩尾雄性黃顙魚的染色體制片, 且每張制片觀察分析了65個(gè)以上的中期分裂相, 其中期分裂相中雜交信號(hào)的檢出率為 13.8%—22.6%, 平均檢出率為17.3% (表1)。

表1 具有雜交信號(hào)中期分裂相的百分率Tab. 1 Percentages of metaphases with hybridized signals

在油鏡下觀察并拍照分析染色體數(shù)目完整、帶型清晰的黃顙魚頭腎細(xì)胞的中期分裂相。如圖1所示, 中期分裂相中的染色體為紅色, 僅在一條染色體上顯示有黃綠色的雜交信號(hào)(箭頭所示), 該信號(hào)即為Pf62-Y探針在黃顙魚染色體上的定位。

我們還測(cè)量分析了雜交信號(hào)所在的染色體(圖2), 經(jīng)測(cè)量和統(tǒng)計(jì)分析, 該染色體的臂比平均值為 1.4±0.2, 為中部著絲粒染色體; 雜交信號(hào)位于其短臂上, 定位于著絲粒的近端。

3 討論

圖1 Pf62-Y在黃顙魚染色體上的定位Fig. 1 Chromosomal localization of Pf62-Y in yellow catfish

在脊椎動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化中, 魚類處于承前啟后的關(guān)鍵位置。魚類性別決定往往易受外界環(huán)境的影響, 雌雄同體、環(huán)境決定型等性別類型在魚類中也較普遍, 且易發(fā)生逆轉(zhuǎn)[10]。具有性染色體的魚類僅為少數(shù), 并且除經(jīng)典的XX／XY型, 還有ZW／ZZ等其他類型的性染色體[11,12]。本研究利用FISH技術(shù)將Pf62-Y片段探針定位于單一染色體上, 在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證黃顙魚性別決定類型為XY型, 其雜交顯示的染色體即為黃顙魚的Y染色體。由于觀察的各分裂相所處的分裂時(shí)期不盡相同, 染色體濃縮程度、構(gòu)型空間變化不同等, FISH雜交信號(hào)會(huì)受到染色體內(nèi)部空間構(gòu)型動(dòng)態(tài)變化的影響而出現(xiàn)雜信號(hào)現(xiàn)象[11]。

總之, 本研究通過黃顙魚Pf62-Y性別標(biāo)記的染色體定位, 觀察到黃顙魚 Y染色體的存在, 可見黃顙魚是研究魚類性別決定機(jī)制和性染色體進(jìn)化的理想材料, 進(jìn)一步研究將有可能獲得更為重要的進(jìn)展。

圖2 信號(hào)所在染色體的結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Structural analysis of chromosomes with the hybridized signal

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CHROMOSOMAL LOCALIZATION OF SEX-LINKED MARKER Pf62-Y IN YELLOW CATFISH

DAN Cheng1,2, WANG Da1,2and GUI Jian-Fang1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

黃顙魚; 性別連鎖標(biāo)記; 熒光原位雜交; 染色體定位

Yellow catfish; Sex-linked marker; FISH; Chromosomal localization

Q343.2

A

1000-3207(2014)01-0184-03

10.7541/2014.25

2012-12-03;

2013-10-13

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(200903046); 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題(2011FBZ17)資助

丹成(1987—), 男, 江西九江人; 碩士研究生; 主要從事魚類發(fā)育遺傳學(xué)研究。E-mail: danchengx@163.com

桂建芳, E-mail: jfgui@ihb.ac.cn